Cut-loading: Uma ferramenta útil para examinar a extensão da Gap Coupling Tracer junção entre neurônios da retina
12 de janeiro de 2012
Um método fácil e conveniente para determinar a extensão do hiato de acoplamento tracer junção entre os neurônios da retina é descrito. Esta técnica permite uma para investigar a função das sinapses elétricas entre os neurônios na retina intacta sob condições de iluminação diferentes e em momentos diferentes do dia e da noite.
O objetivo geral do seguinte experimento de carregamento por corte é examinar o grau de acoplamento por meio de junções comunicantes entre neurônios na retina intacta sob condições controladas de iluminação. O primeiro passo é realizado cortando as retinas com uma lâmina afiada mergulhada em uma solução de neurobiotina, uma molécula rastreadora que pode difundir-se através de canais de junções comunicantes abertos, mas não através das membranas celulares. No segundo passo, as retinas são incubadas em solução de Ringer, o que permite a difusão do rastreador através dos canais de junções comunicantes abertos.
Se o acoplamento por junções do tipo fenda for fraco, a fluorescência da biotina neural será restrita aos neurônios retinianos próximos ao corte. Em contraste, se o acoplamento por junções do tipo fenda for forte, a fluorescência será detectada em neurônios retinianos distantes do corte. A principal vantagem do carregamento por corte em relação às técnicas existentes é que ele é mais fácil de realizar em neurônios com corpos celulares pequenos em tecido retiniano neural intacto.
Também é mais fácil controlar as condições de iluminação durante o carregamento com cortes do que durante um estudo eletrofisiológico de neurônios individuais em tecido retiniano intacto. Porque os estímulos luminosos utilizados durante a gravação elétrica podem por si mesmos provocar alterações no acoplamento por junções comunicantes, demonstrando a técnica será o Dr. Chu Choi, um pós-doutorando do meu laboratório. Neste procedimento, um peixe-dourado é mantido em escuridão constante durante o dia por pelo menos uma hora antes da cirurgia, e todos os passos seguintes até a fixação do tecido retiniano também são realizados durante o dia em escuridão constante, anestesiando profundamente o peixe-dourado mediante adição de 150 miligramas por litro de metano sulfonato à água do aquário.
Em seguida, sacrifique o peixe-dourado de acordo com as diretrizes federais e universitárias e remova cuidadosamente seus bulbos oculares. A seguir, remova a porção anterior de cada bulbo ocular. Então, coloque um pedaço de papel de filtro sobre a porção posterior do olho e inverta o papel de filtro e o olho, de modo que o papel de filtro fique abaixo da porção posterior do olho.
Agora, remova suavemente a parte posterior do olho, incluindo a esclera e o epitélio pigmentado do peixe dourado adaptado à escuridão. Corte o nervo óptico da retina com uma pinça fina. A retina neural do peixe dourado, com a face dos fotorreceptores voltada para cima, deve agora estar aderida ao papel filtro antes da enucleação, enquanto o peixe está sob anestesia em cinco mililitros de solução ringer à base de carbonato oxigenada, com ou sem a droga em teste, adicionada a cada poço de uma placa de seis poços, após a dissecação da retina neural intacta da porção posterior do olho.
Transfira as retinas para os poços durante a escuridão constante. Em seguida, feche os poços com paraforma e deixe o tecido incubando por 30 minutos. Prepare 100 microlitros de solução traçadora dissolvendo 0,5% neuro biotina em solução de Ringer imediatamente antes de cortar através da retina.
Em seguida, adicione a solução de biotina neural a uma placa de Petri de vidro. Depois, toque suavemente o papel-filtro ao qual a retina está aderida sobre uma toalha de papel para remover o anel excessante. Mergulhe uma lâmina de barbear na solução de biotina neural e faça um corte radial perpendicular através da retina e do papel-filtro.
Em seguida, mergulhe a lâmina de barbear novamente na solução de biotina neural e corte a retina uma segunda vez. Repita esse procedimento até quatro cortes por retina. Nesta etapa, transfira a retina para solução de Ringer fresca, com ou sem o fármaco em teste, durante 15 minutos para permitir o carregamento e a difusão.
Lave-o três vezes com solução de Ringer fresca, meio com ou sem a droga em teste, durante cinco minutos cada. Em seguida, fixe a retina com paraformaldeído a 4% em solução tampão fosfato 0,1 molar, à temperatura ambiente, durante uma hora. Posteriormente, lave a retina com PBS 0,1 molar durante a noite a quatro graus Celsius, colocando-a em um refrigerador no dia seguinte.
Incube a retina com streptavidina Alexa 488 a 2% em PBS 0,1 molar e Triton X-100 a 0,3% até uma concentração final de 10 microgramas por mililitro e incube durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, lave a retina três vezes com PBS 0,1 molar à temperatura ambiente, cada vez durante 10 minutos.
Destaque a retina do papel filtro em PBS. Em seguida, utilizando um pincel fino, monte a retina com o lado dos fotorreceptores voltado para cima em uma lâmina com meio de montagem Vector Shield. Transfira a lâmina para um microscópio confocal de varredura a laser e capture imagens com a mesma resolução de aumento e configurações para todas as condições experimentais, de modo que possam ser feitas comparações dos efeitos de diferentes condições experimentais sobre a extensão do acoplamento por tracers funcionais de lacunas, conforme mostrado.
Aqui está o grau de acoplamento do marcador de células fotorreceptoras durante o dia em escotopia constante em comparação com o dia em escotopia constante na presença de um antagonista seletivo do receptor de dopamina D dois. Observe que o corte com lâmina em ambas as imagens está à esquerda. Embora uma única imagem possa conter todas as células marcadas, recomenda-se coletar uma pilha Z da área de interesse e combiná-la em uma única imagem mostrada.
Aqui está o grau de acoplamento do marcador de células fotorreceptoras ao se percorrer sequencialmente um Zack. Observe que o corte com lâmina nesta imagem está à direita. Para quantificar o grau de acoplamento do marcador no navegador de imagens LSM, abra a imagem, clique em exportar e salve a imagem como um arquivo TIF de 16 bits sem compressão; a escala deve ser incluída nesta imagem TIF utilizando o software NIH Image J.
Meça a intensidade de fluorescência do neurobiotina marcado com Alexa 488 a partir de imagens de retina montada em orifício com baixa ampliação. Abra o arquivo TIFF usando o software ImageJ e, em seguida, desenhe uma linha reta correspondente à barra de escala. Em seguida, vá até analisar, defina a escala e insira a distância conhecida e a unidade de comprimento.
Em seguida, clique em OK. Agora, as medições de fluorescência podem ser apresentadas em unidades calibradas, como milímetros. Após isso, selecione a área de interesse utilizando a ferramenta de seleção retangular.
O pico da fluorescência deve ser posicionado na borda esquerda da sua seleção. Certifique-se de que não há sinal fluorescente próximo à borda direita. Clique em analisar e traçar o perfil para os dados de controle diurno obtidos em escuro constante.
Uma curva com decaimento exponencial é exibida da esquerda para a direita. Em seguida, clique em copiar na janela pop-up e cole no Excel. Agora existem duas colunas, uma mostrando a distância a partir do corte e a outra mostrando a intensidade de fluorescência como função da distância a partir do corte.
Como comparação, os passos acima são repetidos com dados obtidos em escuridão constante durante o dia. Na presença de spit bro, divida cada valor bruto de fluorescência pelo valor máximo de fluorescência para obter a intensidade relativa de fluorescência. Copie duas colunas correspondentes à distância do corte e à intensidade relativa de fluorescência, e então cole-as no software Origin.
Esses passos são demonstrados tanto para o controle diurno quanto para a saliva diurna. Os dados obtidos neste ponto são ajustados aos resultados com a função de decaimento exponencial. Função número um: compare os valores da constante espacial em diferentes condições experimentais utilizando um teste T ou ANOVA.
Funções exponenciais e análises estatísticas dos dados de controle diurno, piprona diurna e controle noturno são apresentadas para comparação. Aqui estão exemplos do grau de acoplamento de células fotorreceptoras marcadas com traçador na retina de peixe-dourado adaptada à escuridão durante o dia A, a noite B e durante o dia na presença de um antagonista seletivo do receptor de dopamina D2, conforme revelado pela técnica de carregamento por corte. Todas as imagens confocais foram obtidas usando as mesmas configurações para fins comparativos.
Neste gráfico, a intensidade de fluorescência para três condições experimentais é representada em função da distância em relação ao corte e ajustada por uma função exponencial. A técnica de carregamento por corte é utilizada para quantificar o grau de acoplamento por marcadores nas junções do tipo gap, calculando-se os valores da constante espacial, conforme mostrado aqui para três condições experimentais. A técnica de carregamento por corte também pode ser usada para investigar as sinapses elétricas entre outros tipos celulares na retina e em outras espécies.
Por exemplo, essas duas figuras ilustram que os neurônios horizontais do tipo A e do tipo B em coelhos exibem acoplamento homólogo por traçador após carga por corte e difusão de neurobiotina em condições de escotopia. Utilizamos a técnica de carga por corte para estudar o grau de difusão do traçador através das junções comunicantes entre bastonetes e cones durante o dia e a noite. Além disso, essa técnica pode ser usada para determinar se o acoplamento por traçador entre outros neurônios retinianos é controlado pelo relógio retiniano e/ou por condições específicas de luz e escuridão.
Também pode ser utilizado para estudar o acoplamento de traçadores entre neurônios em outras regiões cerebrais.
Visão Geral
Este artigo descreve um método para determinar o grau de acoplamento por traçadores de junções do tipo fenda entre neurônios da retina. A técnica permite a investigação de sinapses elétricas na retina intacta sob diferentes condições de iluminação.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia da retina
- Comunicação celular
Contexto
- As junções em fenda facilitam a comunicação entre neurônios.
- A compreensão do acoplamento por traçadores pode revelar informações sobre a função neuronal.
- Os métodos existentes podem ser desafiadores para corpos celulares pequenos em tecidos intactos.
- As condições de iluminação podem afetar o acoplamento das junções em fenda.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método prático para avaliar o acoplamento por junções do tipo fenda.
- Investigar os efeitos da iluminação sobre sinapses elétricas em neurônios da retina.
- Aprimorar as técnicas existentes para o estudo de estruturas neuronais pequenas.
Métodos Utilizados
- As retinas são cortadas e carregadas com traçador de biotina neuro.
- A incubação em solução de Ringer permite a difusão do traçador.
- A fluorescência é analisada para avaliar a intensidade do acoplamento.
- As condições experimentais são controladas para minimizar influências externas.
Resultados Principais
- A intensidade da fluorescência indica o grau de acoplamento do traçador.
- Os resultados variam conforme as condições de iluminação e o horário do dia.
- A carga por corte mostra-se eficaz para estruturas neuronais pequenas.
- Facilita-se a análise comparativa entre diferentes configurações experimentais.
Conclusões
- O método de carregamento por corte é uma ferramenta valiosa para o estudo de neurônios da retina.
- As condições de iluminação impactam significativamente o acoplamento por junções do tipo gap.
- Essa técnica pode aprimorar nossa compreensão da comunicação neuronal.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A avaliação da comunicação mediada por junções do tipo gap em neurônios da retina auxilia na validação de alvos na descoberta de fármacos em neurociência, permitindo a redução de riscos mecanicistas de moduladores sinápticos. A técnica de corte-carregamento fornece dados quantitativos e com resolução espacial sobre a difusão de traçadores sob iluminação controlada, aumentando a confiabilidade preditiva em estudos iniciais de engajamento de alvos. Esta abordagem supera uma barreira técnica fundamental no estudo de estruturas neuronais pequenas em tecido intacto, facilitando o desenvolvimento reprodutível de ensaios para esclarecimento de vias.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas mediante a quantificação do acoplamento por traçadores de junções comunicantes como parâmetro funcional da intensidade sináptica elétrica.
- Valor Operacional: Apoia a redução de riscos biológicos por meio de medidas padronizadas de difusão de traçadores que esclarecem a modulação do alvo por neurotransmissores ou fármacos.
- Valor Preditivo: Facilita a triagem de portfólios ao fornecer valores quantitativos da constante de espaço que refletem a eficácia do acoplamento em diferentes condições experimentais.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão para Ensaios: Gera sistemas biológicos validados (retinas intactas) com permeabilidade de junções comunicantes adequada para triagem de compostos em etapas subsequentes.
- Reprodutibilidade: Permite protocolos padronizados de carregamento e difusão de marcadores sob escuridão constante, reduzindo a variabilidade decorrente de alterações na condutância induzidas pela luz.
- Saída Quantitativa: Produz perfis de intensidade de fluorescência que podem ser normalizados e ajustados a modelos de decaimento exponencial para comparação entre condições.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para Doenças: Apoia a investigação da regulação circadiana das junções comunicantes na retina, um mecanismo relevante para distúrbios do processamento visual.
- Continuidade Translacional: Conecta a validação inicial de alvos em fase de descoberta com a continuidade pré-clínica, permitindo a avaliação consistente do acoplamento de marcadores em condições de luz/escuro.
- Decisões Ajustadas ao Risco: Fornece dados sobre os efeitos de moduladores (por exemplo, antagonistas do receptor D2) para orientar decisões de avanço ou interrupção com base em evidências de engajamento do alvo.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método integra-se aos fluxos de trabalho de descoberta inicial ao permitir testes de hipóteses sobre moduladores de junções comunicantes antes da identificação do composto líder, com resultados que informam diretamente a confiança no alvo e a análise de vias.
- Biologia da Descoberta: Apoia a redução de riscos mecanicistas ao isolar o efeito da iluminação e de agentes farmacológicos na difusão do traçador através das junções comunicantes.
- Triagem: Fornece preparações de tecido prontas para ensaio com difusão quantificável do traçador, permitindo avaliação confiável dos efeitos de compostos no acoplamento neuronal.
- Análises: Gera medidas calibradas de intensidade de fluorescência e constante espacial que permitem comparação estatística (por exemplo, teste T) da intensidade do acoplamento entre diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se ao trabalho pré-clínico ao permitir a avaliação da regulação do acoplamento por relógio retiniano e ciclos claro/escuro, relevante para modelos de doenças.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma plataforma reutilizável para o estudo do acoplamento por junções comunicantes entre diferentes tipos neuronais e espécies retinianas, reduzindo o desenvolvimento metodológico redundante.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade mecanicista na comunicação sináptica elétrica.
- Valor Operacional: Aprimora a padronização e reprodutibilidade por meio de iluminação controlada e procedimentos padronizados de carregamento de traçadores.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência de capital ao permitir decisões mais precoces de prosseguir/não prosseguir com base em dados quantitativos de engajamento do alvo.
- Impacto sobre o Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco ao fornecer dados empíricos sobre os efeitos de moduladores em diferentes condições temporais e farmacológicas.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em dissecação retiniana, manipulação de traçadores e microscopia de fluorescência em condições controladas de escuridão.
- Depende de instrumentação para microcorte, incubação, imageamento confocal e quantificação de fluorescência (por exemplo, ImageJ, Origin).
- Necessita padronização entre equipes dos protocolos de iluminação, concentração de traçadores e profundidade de corte para garantir medidas reprodutíveis de acoplamento.
- Envolve considerações de adaptação ao aplicar a técnica a outros sistemas neuronais ou espécies com diferentes espessuras de tecido e permeabilidade das junções comunicantes.
- As limitações práticas incluem a necessidade de traçadores permeáveis, como neurobiotina, e a incapacidade de avaliar diretamente sinapses elétricas não acopladas por traçadores.
