Estudo do citoesqueleto de actina em Live Células Endoteliais Expressando GFP-Actina

O objetivo deste procedimento é observar as mudanças dinâmicas no citoesqueleto de actina em células endoteliais vivas. Primeiro, transfete células endoteliais de veia umbilical humana com um plasmídeo de actina beta GFP e cultive-as até atingirem confluência em lamínulas. Em seguida, posicione as lamínulas em uma câmara de imagem de células vivas com uma platina aquecida e infusão de solução fisiológica com albumina.

O passo final é a aquisição de dados de uma área selecionada de células por meio da captura de imagens em intervalos de tempo antes e após o tratamento com um agente farmacológico. A análise do gráfico de Chime com software de imagem, como o Image J, pode fornecer informações sobre protrusões locais de lâminas podiais, tais como distância, tempo e velocidade das protrusões, bem como o movimento das fibras de actina ao longo do tempo. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a imagem de imunofluorescência, é que a microscopia de células vivas permite incorporar a natureza dinâmica do citoesqueleto de actina em estudos dos mecanismos que determinam a permeabilidade endotelial.

Enquanto as células coradas fixadas representam instantâneos no tempo e fornecem pouca informação sobre a dinâmica do ato e do citoesqueleto antes e depois do tratamento com um mediador inflamatório em uma cabine de segurança biológica. Esterilize lamínulas com etanol 70% por dois minutos e, em seguida, deixe secar ao ar. Coloque cada lamínula em uma placa de cultura de 10 centímetros e adicione 300 microlitros de solução morna de gelatina ao centro, sem tocar nas bordas da lamínula. Após cinco minutos, aspire o líquido.

Agora, colete uma cultura confluente de células endoteliais de veia umbilical humana ou VE com tripsina 0,25% EDTA. Conte as células e recupere-as por centrifugação. Aspire cuidadosamente o máximo possível do meio SUP natum para uma reação de transfeção com o kit de efetor nuclear VE.

Re-suspenda os pellets celulares na solução básica de efetor nuclear e adicione de 0,2 a dois microgramas do plasmídeo do vetor GFP beta actina. Transfira 100 microlitros da suspensão celular para um cubeta de efetor nuclear. Bata levemente na cubeta tampada algumas vezes para garantir que não haja bolhas entre o fundo da cubeta e a amostra de transfeção.

Coloque o Q VET no dispositivo efetor nuclear dois e execute o programa A 0 3 4 utilizando uma pipeta de transferência do kit efetor nuclear para transferir um quarto aquecido de 500 microlitros de meio EGM dois MV para o qve. Em seguida, transfira a mistura de volta para o tubo microfuga e incube por 15 minutos. Misture suavemente a suspensão VE transfectada uma vez e plaque 300 microlitros da suspensão sobre um lamínula revestido com gelatina, sem tocar nas bordas.

Em seguida, incubar por uma a quatro horas. Examinar as células transfectadas para confirmar a adesão à lamínula. Então, adicionar 10 mililitros de meio E GM dois MV à placa e continuar a incubar para expressão de GFP.

Primeiro, adicione um meio de solução salina fisiológica com albumina ou um PSS ao sistema de fluxo por gravidade e conecte ao aquecedor em linha. Ajuste agora o regulador de fluxo para obter um fluxo de aproximadamente 40 mililitros por hora. Em seguida, interrompa o fluxo fechando a torneira com um aplicador de algodão.

Aplicar graxa de vácuo na borda externa da parte inferior do banho de diamante. Agora, retire uma cultura transfectada do incubador. Levante cuidadosamente a lamínula usando pinça.

Em seguida, utilizando um lenço de papel Kim, absorva o meio EGM dois MV em excesso na lâmina inferior, posicionando a face celular voltada para cima. Coloque o banho de diamante sobre a lamínula para formar uma câmara. Coloque rapidamente a câmara no aquecedor do estágio.

Ajuste as braçadeiras sobre a câmara e pipete aproximadamente um mililitro de meio EGM two MV da placa para dentro da câmara. Agora, conecte a mangueira de vácuo ao seu suporte no lado esquerdo da câmara e a linha de A PSS do aquecedor em linha ao canal no lado direito da câmara. Em seguida, ligue o vácuo e abra a linha de A PSS para permitir a perfusão do banho sobre as células transfectadas.

Também ligue o aquecedor interno em 37 graus Celsius. Em seguida, coloque a sonda termistora do estágio aquecido na borda do banho e ligue o aquecedor do estágio em 37 graus Celsius. Para remover qualquer resíduo restante de meio EGM dois MV e acúmulo, limpe cuidadosamente o lado inferior do lamínula usando um lenço Kim embebido em etanol 70%, seguido por um lenço Kim seco. Equilibre as células HU transfectadas por 30 minutos.

Trave o foco. Concentre-se na área selecionada das células cultivadas para estudo. Ajuste o tempo de exposição da câmera entre 0,5 e dois segundos, dependendo da intensidade do sinal GFP Act nas células.

Defina também os intervalos e os tempos de duração do experimento. Agora, com as luzes do ambiente desligadas, capture uma única imagem para avaliar as configurações. Capture a série de imagens em lapso de tempo, monitorando-as conforme forem necessárias.

Em um protocolo típico, obtenha imagens de linha de base por 20 a 30 minutos antes de adicionar um agente de teste, seguido por 0,5 a quatro horas de aquisição adicional de imagens. Por fim, conforme detalhado no texto acompanhante, avalie a distância de protrusão de lâminas podiais, a persistência e a velocidade por meio da análise de gráficos de CH. Em um experimento típico, a actina GFP é expressa em mais de 50% das VE transfectadas de maneira aleatória.

Essas imagens adquiridas uma vez por minuto capturaram a actina GFP em todo o citoplasma, bem como em estruturas filamentosas e em protrusões locais de filopódios ao longo da borda celular. A persistência de distância e a velocidade das protrusões celulares são quantificadas a partir de conjuntos de imagens com lapso de tempo. Utilizando a análise de gráfico chm, primeiramente, uma linha de um único pixel é traçada aproximadamente perpendicular à borda da célula.

Essa região é extraída de cada imagem do conjunto de imagens de lapso de tempo para gerar um mosaico da região ao longo do tempo ou um gráfico de sino, aqui numa perspectiva da esquerda para a direita no gráfico de sino, as projeções são representadas como movimentos ascendentes na borda da célula. Quando uma linha é sobreposta à borda de uma dessas projeções, os dados dos pixels associados a essa linha podem ser coletados para quantificar a dinâmica das projeções. O número total de projeções em um gráfico de sino pode ser usado para estimar a frequência de projeções.

Esta análise retrata os movimentos das fibras de estresse formadas próximo à periferia celular e que se deslocam em direção ao centro da célula, onde eventualmente se desmontam. No gráfico chio, as fibras de estresse aparecem como linhas contínuas na área citoplasmática, muitas vezes movendo-se para baixo e para a direita em direção ao centro celular. Quando as fibras são difíceis de visualizar no gráfico chio original, o filtro de máscara de realce aumenta o contraste das linhas da imagem, e as linhas desenhadas sobre as fibras de estresse facilitam a coleta de dados dos pixels usando a função de medição. Alternativamente, linhas traçadas do início ao fim da fibra de estresse identificada permitem obter uma média ponderada dos dados de pixels durante todo o período em que a fibra foi observada.

Esta apresentação demonstrou como analisar dados provenientes do conjunto de imagens de lapso de tempo por meio de análise gráfica com softwares como o ImageJ. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como estudar a dinâmica do citoesqueleto de actina em resposta a mediadores inflamatórios utilizando a imagem de células endoteliais transfectadas vivas.