Do-It-Yourself Dispositivo de Recuperação de amostras criopreservadas cair acidentalmente em Tanques de armazenamento criogênico

O objetivo deste procedimento é facilitar a recuperação de amostras em caixas criogênicas e frascos criogênicos de tanques duplos preenchidos com nitrogênio líquido, utilizando um dispositivo de fácil construção. Isso é realizado primeiramente removendo uma ou duas grades congeladoras do tanque para liberar espaço para manobras e inserindo o dispositivo verticalmente no tanque. O segundo passo consiste em raspar suavemente ao longo do fundo do tanque com o dispositivo.

Em seguida, puxe o dispositivo na posição vertical ao longo das paredes do tanque. Para retirar a caixa congeladora do tanque, o passo final consiste em pegar a caixa recuperada do fundo do tanque e reposicionar as prateleiras congeladoras removidas. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como a decantação ou o manuseio de um recipiente cheio de nitrogênio líquido, é que ela oferece uma alternativa fácil, segura e rápida, que preserva a integridade das amostras e pode ser realizada por um único operador. Para iniciar a montagem do dispositivo criotolerante, utilize um alicate para endireitar um dos lados de um grampo reforçado de três lados, transformando-o em um grampo reforçado em forma de L.

Como visto aqui, as dimensões do prendedor resistente podem ser selecionadas conforme o diâmetro do pescoço do dispositivo. Devem ser feitos dois desses prendedores resistentes para permitir que o dispositivo recolha caixas de criopreservação de cinco polegadas e meia por cinco polegadas e meia. Fixe-os com uma correia TST de prendedor resistente utilizando um parafuso tipo coroa, porca, arruela e parafuso para formar a base da pás de criopreservação.

O dispositivo agora deve aparecer conforme visto aqui. Agora, usando uma placa ranhurada, alinhe as ranhuras da braçadeira em T resistente com as ranhuras em uma das extremidades da placa ranhurada. Em seguida, fixe os dois juntos com porcas e parafusos Hillman.

Faça furos para fixação caso a chapa ranhurada e os conectores não tenham furos pré-perfurados. Se desejar, pode-se formar um cabo dobrando a outra extremidade da chapa ranhurada e envolvendo-a com espuma. Para segurar melhor o dispositivo, certifique-se de remover a espuma antes do fechamento na água.

O dispositivo de recuperação caseiro tolerante ao congelamento também pode ser adaptado para a recuperação de frascos criogênicos. Isso envolve substituir a base plana por um coador de aço inoxidável modificado para retirar os frascos do líquido. Para iniciar a montagem, primeiro desparafuse as porcas e parafusos da coroa, fixando a tira resistente em formato de T na placa ranhurada.

Em seguida, antes de fixar o coador de aço inoxidável à placa ranhurada, dobre levemente o pescoço do coador com a ajuda de um alicate para orientar a base em um ângulo, assemelhando-se a uma concha. Se o coador utilizado possuir uma borda, use o alicate para dobrar a borda para baixo. Isso facilitará a manipulação do dispositivo.

Alinhe o orifício na alça do escorredor com os orifícios na placa ranhurada e fixe o escorredor usando porcas e parafusos Hillman. Faça furos, caso o escorredor não venha com furos pré-perfurados. Para começar a retirar caixas de criopreservação de um tanque, certifique-se primeiro de colocar luvas criogênicas.

Em seguida, remova uma ou duas prateleiras do congelador para liberar espaço para manobrar com o dispositivo. Depois, use o dispositivo caseiro resistente ao criogenia, na posição vertical e equipado com a base de amarração resistente, para raspar suavemente ao longo do fundo do congelador e recolher a caixa, que caiu no fundo do tanque do congelador. Em seguida, puxe o dispositivo verticalmente ao longo das paredes do congelador para levantar a caixa do congelador para fora do tanque.

Observe que o dispositivo deve ser mantido verticalmente e puxado diretamente para cima para evitar que a caixa escorregue de volta para o interior do doer. Para recuperar os frascos criogênicos, utilize a espátula criogênica equipada com um coador para raspar suavemente o fundo do doer, de maneira semelhante à recuperação da caixa criogênica, eleve o dispositivo na posição vertical e pegue os frascos acumulados no coador. Um grande desafio nos estudos de expressão gênica é que a qualidade do RNA depende das condições de armazenamento tanto das amostras de tecido congeladas quanto do RNA extraído.

Esta figura mostra o efeito do manuseio da amostra na integridade do RNA total. O RNA total proveniente da mesma fonte tecidual foi submetido a diferentes manuseios antes do experimento. O RNA total intacto apresenta bandas claras de RNA ribossômico 28 s e 18 s, sendo a banda de RNA ribossômico 28 s aproximadamente duas vezes mais intensa que a banda de RNA ribossômico 18 s. Isso indica que o RNA está intacto. As linhas três e quatro mostram amostras com degradação significativa devido a descongelações parciais repetidas por retiradas de curto prazo do congelador, simulando armazenamento de longo prazo com descongelações periódicas causadas pela necessidade de recuperação de frascos caídos nas caixas.

No entanto, amostras armazenadas no serviço doer utilizando o dispositivo DIY e, portanto, sem descongelamento parcial, contêm RNA intacto na faixa dois. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como recuperar amostras do dvar preenchido com nitrogênio líquido sem a necessidade de decantá-lo.