Visualizando Proteínas e Complexos Macromoleculares por Negative EM Stain: Preparação de Grid para Aquisição de Imagem
22 de dezembro de 2011
Amostras de proteínas visualização por microscopia eletrônica negativa mancha (EM) tornou-se um método de análise estrutural populares. É útil para a análise estrutural quantitativa, como cálculo de uma reconstrução 3D das moléculas em estudo, e também para a análise qualitativa da qualidade de preparações de proteína. Neste artigo apresentamos protocolos detalhados para preparar as grades EM, a coloração da amostra e visualizar a amostra em um microscópio eletrônico. Usuários novatos podem seguir estes protocolos facilmente e utilizar negativa mancha EM como um ensaio de rotina, além de outros ensaios bioquímicos, para avaliar as suas amostras de proteína.
O objetivo geral deste procedimento é visualizar amostras de proteínas purificadas por microscopia eletrônica de contraste negativo. Isso é realizado primeiramente preparando as grades de microscopia eletrônica que suportarão a amostra. O segundo passo do procedimento é preparar a solução de contraste negativo.
Em seguida, a amostra é aplicada na grade de microscopia eletrônica e submetida à coloração negativa. Por fim, a grade de ME é inserida no microscópio eletrônico e as imagens são registradas sob condições ópticas apropriadas. As imagens convencionais em campo claro, DEM, apresentam alto contraste e detalhes nítidos, mostrando macromoléculas individuais dispersas sobre um fundo sem características.
A microscopia eletrônica com contraste negativo é um método simples de visualizar sua proteína de interesse. Pode ser usada como um ensaio de rotina para examinar sua proteína purificada, seja para análise estrutural ou outros ensaios bioquímicos e biofísicos. Aqui demonstramos como preparar uma amostra com contraste negativo para microscopia eletrônica.
A demonstração visual deste método é útil, pois algumas das etapas são difíceis de aprender apenas por meio de descrições textuais e figuras. Comece usando uma pipeta de vidro para colocar uma única gota de colódio em um béquer grande com água, sobre a superfície da água. À medida que o colódio se espalha, ele pode capturar poeira da superfície da água.
Remova e substitua uma película empoeirada de plástico de colódio por outra gota. Em seguida, coloque entre 50 e 100 grades de ME, uma a uma, sobre a película plástica flutuante, com o lado brilhante voltado para baixo. Selecione grades de 400 malhas para coloração negativa de rotina e selecione grades de 200 malhas.
Para coletar imagens em pares de inclinação. Selecione um pedaço de papel com baixa absorção e sem rugas, ligeiramente maior que a área das grades. Coloque o papel sobre as grades e aguarde até que o papel fique completamente encharcado.
O papel não deve absorver a água muito rapidamente. Utilizamos papel de um bloco de anotações barato. As grades estão agora entre a película de plástico e o papel.
Use um par de pinças para colocar o papel em uma placa de Petri para secar lentamente ao ar. Evite métodos de secagem mais rápidos, pois podem causar rugas. A máquina de revestimento com carbono utilizada em nosso laboratório é um aparelho Creston 2 0 8 C de vácuo alto com turbo carbonizador.
Equipado com um monitor de espessura de filme Creston. O monitor utiliza um balanço de quartzo sensível a depósitos de carbono. No entanto, o protocolo descrito aqui não requer este dispositivo. Comece afiando e carregando as barras de carbono em uma máquina de revestimento com carbono.
Em seguida, recubra um porta-objetos de vidro com graxa de vácuo, deixando metade da área fosca sem recobrimento. Após o recobrimento com carbono, as regiões engraxadas do porta-objetos são usadas para estimar a espessura do revestimento de carbono. Coloque o papel com as grades na platina sob o recipiente de vidro da máquina de recobrimento com carbono. Posicione o porta-objetos engraxado.
Deslize próximo às grades. Bombeie a câmara de vácuo até pelo menos 10 micra de torr; caso contrário, faíscas gerarão muitas partículas grandes na grade. Agora, aumente a corrente muito lentamente.
A ponta afiada da haste de carbono ficará extremamente brilhante. Não a observe a olho nu enquanto o revestimento começa; a lâmina de vidro mudará de cor para um cinza escuro à medida que a camada de carbono se acumula. Interrompa a corrente na espessura desejada de carbono e leve em consideração a transparência do recipiente de vidro. Ao fazer essa avaliação, uma vez que a escuridão da lâmina seja calibrada de acordo com a espessura do carbono, este método é tão preciso quanto o monitor de espessura de filme, mais caro.
Quando o processo terminar, libere o vácuo da câmara e remova as grades revestidas para uso posterior. A camada fina de plástico não afetará a qualidade da imagem com contraste negativo, mas pode ser removida mergulhando as grades em clorofórmio por várias horas antes de prosseguir. Prepare uma solução fresca de uranil formiato ou use uma solução que tenha sido armazenada no escuro por menos de duas semanas.
Uma solução fresca de boa qualidade apresenta cor amarela, pH em torno de quatro e apresenta corrida muito limpa, sem precipitados. Comece utilizando um sistema comercialmente disponível para fazer brilhar. Descarregue as grades revestidas com carbono.
Em seguida, coloque duas gotas de 20 microlitros de água destilada e duas gotas de 25 microlitros de solução fresca de formiato urinário sobre um pedaço de perfil. Usando pinças de força reversa anticaspa capilar, segure uma grade descarregada por brilho, com o lado revestido de carbono voltado para cima. Criticamente, essas pinças não sugam o líquido das grades.
Agora aplique dois microlitros da amostra de proteína na grade e aguarde enquanto as proteínas são absorvidas pela grade. Isso geralmente leva 30 segundos, mas amostras muito diluídas exigirão mais tempo, o que pode afetar as concentrações do tampão. Ao finalizar, remova a amostra de proteína com papel filtro.
Em seguida, lave a grade duas vezes tocando brevemente sua superfície em uma gota de água e secando-a com papel filtro em alguns segundos. Após a água tocar brevemente a grade, coloque-a em contato com uma gota de corante e seque rapidamente. Usando a mesma técnica, deixe a grade em contato com uma segunda gota de corante por 20 segundos.
Por fim, seque a grade ao ar na capela de bancada ou, preferencialmente, em vácuo antes da sessão de microscopia eletrônica; verifique o alinhamento do microscópio de microscopia eletrônica carregando um arquivo de alinhamento aperfeiçoado, se disponível, o que deve restaurá-lo a um estado próximo do perfeito. Agora, carregue a grade de microscopia eletrônica em um suporte padrão de amostra com inclinação simples. Em seguida, insira o suporte na platina.
Em seguida, aguarde a conclusão do ciclo de bombeamento e insira o porta-amostras na coluna. Agora, inicie a busca por uma área da amostra com boa coloração. Foque manualmente utilizando o método de contraste mínimo ou com uma câmera CC, D e calcule os quatro em tempo real.
Seu espectro de potência. Em seguida, ajuste o foco profundo conforme necessário, geralmente para -1,5 mícrons. A concentração da coloração pode variar ao longo da grade, portanto, procure proteínas com contraste branco.
Evite áreas com coloração irregular ou coloração positiva onde o contraste da proteína se torna preto. Utilizando a abordagem descrita para a confecção de grades e visualização de amostras contrastadas negativamente. Diversas proteínas conhecidas foram imagiadas com fins demonstrativos.
Observe os detalhes e o alto contraste. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como gerar amostras de macromoléculas negativamente coradas para observação em microscópio eletrônico. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em cerca de quatro horas.
Após este procedimento, outros métodos como reconstrução tridimensional podem ser realizados para compreender melhor as estruturas moleculares.
Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo detalhado para visualizar amostras de proteínas purificadas utilizando microscopia eletrônica com contraste negativo (EM). O método é acessível para usuários iniciantes e serve como um ensaio rotineiro para análise estrutural de proteínas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia Estrutural
- Microscopia Eletrônica
- Análise de Proteínas
Contexto
- A microscopia eletrônica com contraste negativo é uma técnica amplamente utilizada para visualizar proteínas.
- Ela permite análises estruturais qualitativas e quantitativas.
- Protocolos para preparação e visualização de amostras são essenciais para a aplicação bem-sucedida.
- Este método pode aprimorar a compreensão das estruturas proteicas.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um guia abrangente para o preparo de grades de microscopia eletrônica e coloração de amostras.
- Demonstrar a visualização de proteínas utilizando microscopia eletrônica com contraste negativo.
- Facilitar o uso rotineiro deste método na análise de proteínas.
Métodos Utilizados
- Preparação de grades para microscopia eletrônica.
- Aplicação da solução de contraste negativo a amostras de proteínas.
- Visualização das amostras em um microscópio eletrônico.
- Gravação de imagens em condições ideais.
Resultados Principais
- Foram obtidas imagens de alto contraste de proteínas.
- Protocolos detalhados foram demonstrados com sucesso.
- Auxílios visuais aprimoraram a compreensão das etapas complexas.
- Os resultados apoiam o uso da microscopia eletrônica com contraste negativo para análise rotineira de proteínas.
Conclusões
- A microscopia eletrônica com contraste negativo é um método eficaz para visualização de proteínas.
- Os protocolos fornecidos podem ser facilmente seguidos por usuários iniciantes.
- Essa técnica pode complementar outros ensaios bioquímicos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A microscopia eletrônica de contraste negativo (ME) fornece visualização rápida e de alto contraste de proteínas purificadas e complexos macromoleculares, permitindo a avaliação precoce da qualidade da amostra e do seu estado de montagem. Esta técnica sustenta decisões críticas de continuidade ou interrupção em fluxos de descoberta, confirmando a homogeneidade da amostra e a formação de complexos antes de estudos downstream mais intensivos em recursos. Sua acessibilidade e reprodutibilidade tornam-na uma ferramenta fundamental para equipes de biologia estrutural na indústria biofarmacêutica.&D.
Aplicações Estratégicas em P&D Biofarmacêutico
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a visualização direta de complexos proteicos para confirmar montagem e integridade.
- Permite avaliação rápida da homogeneidade da amostra, reduzindo ambiguidades na validação do alvo.
- Facilita a detecção precoce de agregação ou degradação, minimizando riscos em fluxos de trabalho subsequentes.
- Fornece evidências visuais para apoiar hipóteses mecanicistas na seleção de alvos.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valida a qualidade de preparações proteicas antes da triagem em alta escala ou desenvolvimento de ensaios.
- Garante a reprodutibilidade e padronização das entradas de amostras para ensaios quantitativos.
- Permite a preparação escalonável de grades de microscopia eletrônica validadas para uso repetido em campanhas de triagem.
- Apóia a avaliação confiável dos efeitos de compostos sobre a estrutura ou montagem proteica.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Confirma a integridade estrutural de candidatos terapêuticos antes dos estudos pré-clínicos.
- Alinha dados visuais com ensaios bioquímicos e biofísicos para continuidade translacional.
- Reduz o risco de avançar candidatos com comprometimento estrutural para modelos pré-clínicos.
- Fornece dados fundamentais para reconstruções tridimensionais e estudos mecanicistas subsequentes.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
A microscopia eletrônica com contraste negativo posiciona-se na interface entre a purificação de proteínas e a caracterização estrutural ou funcional, servindo como elo entre a descoberta inicial e a pesquisa pré-clínica.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses por meio da visualização de complexos e montagens proteicos.
- Triagem: Confirma a qualidade e reprodutibilidade das amostras para ensaios subsequentes.
- Análises: Fornece imagens de alto contraste para avaliação quantitativa da homogeneidade da amostra e agregação.
- Pesquisa Translacional: Garante a fidelidade estrutural de candidatos que entram na validação pré-clínica.
- Reutilização Empresarial: Oferece um ensaio padronizado e de rotina, adaptável a diversos alvos proteicos e projetos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na qualidade da amostra e na validação do alvo.
- Valor Operacional: Oferece fluxos de trabalho de visualização rápidos, reprodutíveis e escaláveis.
- Valor Estratégico: Permite decisões informadas de avançar/não avançar e reduz riscos biológicos em estágios avançados.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização e o avanço ajustados ao risco de candidatos com validação estrutural.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência na preparação de grades para microscopia eletrônica e operação do instrumento.
- Necessita de acesso à infraestrutura de microscopia eletrônica e reagentes corantes.
- Exige padronização entre equipes para preparação de amostras e aquisição de imagens reprodutíveis.
- Adaptável a uma ampla variedade de tamanhos de proteínas e tipos de complexos.
- Limitado à visualização de superfícies; não é adequado para análise de estruturas internas com alta resolução.
