Monitoramento de mudanças na estrutura Equilibrium RNA por "peroxidativo" e "oxidativo" Footprinting Radical Hidroxila

O objetivo geral do seguinte experimento é determinar como as moléculas de RNA se dobram utilizando a técnica de mapeamento por radicais hidroxila. Isso é alcançado por marcação em extremidade, purificação em gel e pré-dobramento do RNA, o que garante a integridade conformacional do RNA antes da etapa subsequente de dobramento mediado por magnésio. Em seguida, os reagentes de Fenton são misturados para gerar radicais hidroxila, os quais podem clivar a cadeia principal do RNA de acordo com sua acessibilidade ao solvente. A seguir, os produtos de clivagem do RNA são separados por eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante e visualizados por autorradiografia.

As integrais das bandas são quantificadas por meio de software de análise de footprinting semi-automatizado. O objetivo final é gerar isotermas de dobramento que reflitam a formação da estrutura terciária do RNA. Isso é realizado escalando as integrais das bandas normalizadas para a saturação fracional.

As isotermas podem então ser ajustadas à equação de Hill. A principal vantagem do footprinting com hidroxila é que se obtém informações sobre a estrutura terciária do RNA utilizando produtos químicos de baixo custo, pois os radicais hidroxila de pequeno tamanho apresentam alta atividade, sendo sondas ideais para distinguir entre nucleotídeos acessíveis ao solvente e nucleotídeos enterrados. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da biologia estrutural de RNA.

Por exemplo, como os ribossomos utilizam íons metálicos para atingir sua conformação ativa? A técnica de mapeamento por radicais hidroxila pode ser usada para compreender os fundamentos da especificidade e reconhecimento de RNA. Além de revelar informações sobre a estrutura terciária do RNA, este método pode ser empregado para determinar os sítios exatos de ligação de proteínas em moléculas de RNA ou DNA.

Os principais desafios deste método são prevenir a degradação da amostra por ribonuclease e otimizar a concentração de ferro para obter a quantidade adequada de clivagem de RNA. Além disso, a análise detalhada dos intervalos das bandas pode ser bastante complicada. O principal benefício deste vídeo é ajudar o público a compreender as etapas de planejamento e a execução bem-sucedida de um experimento de mapeamento por radicais hidroxila. Antes do início deste protocolo, prepare todos os reagentes para o mapeamento conforme descrito no protocolo escrito.

Acompanhando este vídeo, o RNA pode ser produzido a partir de quatro DFOs relacionados e marcado na extremidade, conforme descrito. Purifique o RNA marcado radioativamente utilizando eletroforese em gel desnaturante. Recupere o RNA purificado por duas extrações subsequentes em gel usando acetato de sódio 0,3 molar.

Em seguida, precipite o RNA misturando 0,5 mililitros da solução aquosa com um mililitro de etanol. Incube a mistura por um minuto em gelo seco. Após centrifugar a amostra, descarte o sobrenadante. Lave o pellet de RNA com etanol 70%.

Remova o sobrenadante após nova centrifugação e seque o pellet em vácuo. Em seguida, dissolva as amostras de RNA marcado com P 32 purificado. Em 330 microlitros de tampão de reação uma vez, pipete 30 microlitros da solução de RNA em um novo tubo de reação.

Precipite o RNA com etanol e, em seguida, seque o pellet em vácuo; uma vez seco, esse pellet pode ser usado para gerar a escada de referência conforme descrito no procedimento escrito para nature. Desnature o restante da solução de RNA tamponada aquecendo-a a 95 graus Celsius por dois minutos. Deixe as amostras atingirem a temperatura ambiente por 15 minutos e, em seguida, faça uma centrifugação rápida para recolher o condensado de volta à solução. Para iniciar o experimento de footprint, monte 27 tubos de reação, quantidade suficiente para preencher um gel de eletroforese de 30 poços.

Após incluir os marcadores e o controle clivado, determine as concentrações finais de íons de magnésio e ferro para que fiquem uniformemente espaçadas em uma escala logarítmica ao longo de várias ordens de grandeza em torno do ponto médio da titulação. A preparação dos íons de magnésio em tampão de reação uma vez é descrita separadamente no texto. Incube a solução de RNA e as soluções de íons de magnésio a 50 graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, misture 10 microlitros da solução de RNA com 90 microlitros da quantidade correspondente de solução de íons de magnésio e ferro.

Para atingir um volume final de 100 microlitros, incube cada mistura por 30 minutos a 50 graus Celsius. Em seguida, deixe as soluções equilibrarem a 25 graus Celsius por uma hora enquanto ocorre o dobramento do RNA. Enquanto isso, imediatamente antes de iniciar a reação de mapeamento por radicais hidroxila, prepare a mistura de reação fantasma conforme descrito no protocolo escrito.

Prepare a reação de peroxidação pipetando duas gotas de dois microlitros cada uma de ferro EDTA, ascorbato de sódio e peróxido de hidrogênio na parte superior interna do tubo de reação contendo a solução de RNA, de modo que as gotas não entrem em contato. Inicie a reação de mapeamento por pegadas com uma mistura vigorosa. Após 15 segundos, interrompa a reação adicionando 300 microlitros de etanol puro e frio.

Agite os tubos de três a cinco vezes. Por fim, precipite, lave e seque o pellet conforme realizado anteriormente. Como alternativa à reação oxidativa, a reação oxidativa de hidroxila será realizada pela adição de cinco microlitros da mistura recém-preparada de reação de Fenton às amostras. Incube a reação oxidativa por 30 minutos a 25 graus Celsius.

Em seguida, adicione 300 microlitros de etanol puro e frio para interromper a reação e misture invertendo os tubos. Precipite novamente. Lave e seque o pellet após a conclusão da reação peroxidativa ou oxidativa.

Resuspenda os pellets de RNA secos em oito microlitros de corante de carga para gel tipo dois. Confirme que o RNA marcado com P-32 foi ressuspenso utilizando um contador Geiger. Prepare um gel de sequenciamento desnaturante de poliacrilamida a 8% de acordo com protocolos padrão. Usando um pente de 30 poços, carregue as amostras, incluindo dois referenciais e um controle clivado.

Sequencie os fragmentos de RNA a 60 a 75 watts durante duas horas e meia. Exponha o gel seco a uma tela fosfoensomada durante a noite. Analise a tela fosfoensomada com um sistema de imagem para autorradiografia sem filme.

Em seguida, transfira o arquivo de imagem do gel para o computador para análise. Para iniciar a análise dos dados, abra o Safa, um software livre para ajuste e quantificação de banda única. Carregue a sequência de RNA como um arquivo TXT seguido pela imagem do gel como um arquivo GEL.

Defina as faixas e ajuste as intensidades das bandas. Em seguida, escolha uma faixa de referência e realize a atribuição de alinhamento do gel, associando as bandas aos nucleotídeos com base na escada de digestão do RNA T um. Quantifique as intensidades das bandas e utilize a função de gráfico de normalização por cores para normalizar e atribuir resíduos potencialmente invariantes.

Salve a saída como um arquivo txt. O SFA gera uma planilha contendo colunas, que representam as pistas do gel, e linhas que representam os integrais individuais das bandas correspondentes ao fragmento de RNA. Primeiro, os sítios de proteção que exibem uma mudança notável na acessibilidade ao solvente devem ser identificados comparando o perfil de proteção derivado da amostra sem íons de magnésio com o perfil da concentração final de íons de magnésio.

Quanto menor o valor, mais protegido está o nucleotídeo contra ataques pelos radicais hidroxila, e vice-versa. Em seguida, crie curvas de transição da banda, intensidades de nucleotídeos individuais ou grupos em função da concentração de íons de magnésio usando um formato de planilha, escalando individualmente essas transições à função de saturação fracional conforme descrito na parte textual deste protocolo. Como etapa final, ajuste os dados à equação de Hill.

Esta análise ajusta a transição até a saturação fracional, determina o ponto médio da transição e fornece um teste fenomenológico para verificar se a transição é sigmoide. Abaixo estão resultados representativos de experimentos de mapeamento por radicais hidroxila do RNA P4-P6. As isotermas foram derivadas de géis de sequenciamento analisados pelo Safa e, em seguida, ajustadas conforme descrito na seção de análise.

A imagem do gel indica que a clivagem de fundo é mínima e que a atribuição de nucleotídeos individuais é possível devido às faixas bem definidas na pista T. A fragmentação do RNA induzida por radicais hidroxila está bem acima do fundo. A transição de íons de magnésio baixos para altos está seletivamente associada à diminuição da intensidade de faixas individuais e grupos de faixas, indicando a formação de RNA.

A proteção da estrutura terciária refere-se a nucleotídeos únicos ou grupos de nucleotídeos contíguos cuja clivagem altera simultaneamente as intensidades das bandas, as quais são quantificadas e normalizadas por meio da análise saffer. O resultado é um gráfico térmico que visualiza o grau de proteção contra radicais hidroxila. A transição de cor descreve a alteração na acessibilidade após a adição de ferro magnésio: de branco a vermelho indica nucleotídeos mais acessíveis, enquanto de branco a azul indica nucleotídeos mais protegidos.

Cada grau de sombreamento está associado a um valor numérico, que pode ser representado graficamente como uma curva de proteção e analisado por um modelo de ligação, como a equação de Hill. Neste exemplo, a constante de dissociação no equilíbrio associada à proteção de 1 5 3 a 1 5 5 é aproximadamente duas vezes maior que o valor correspondente da proteção de 1 6 3 a 1 6 4. Este experimento de mapeamento por radicais hidroxila pode ser realizado em um dia e meio, se for executado corretamente.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de usar luvas e jaleco de laboratório para evitar qualquer contaminação por RNAs. Além disso, a concentração final de ferro depende do sistema experimental. Por isso, recomendamos realizar um experimento de resposta à dose antes da análise de footprinting seguindo este procedimento.

Outros métodos, como a pegada de radical hidroxila com resolução temporal, podem ser realizados para responder perguntas adicionais. Por exemplo, em qual momento crítico as moléculas de RNA atingem uma conformação incorretamente dobrada ou ativa após seu desenvolvimento? Esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de biologia estrutural explorarem interações terciárias inter e intermediárias de ácidos nucleicos.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como determinar a formação da estrutura terciária de moléculas de RNA. Não se esqueça de que o estágio com cloreto de cálcio e fósforo apresenta riscos; precauções, como o uso de luvas e óculos de proteção, bem como o uso de blindagem de plexiglás, são recomendadas durante a realização deste procedimento.