A realização de experimentos de Microarray personalizado MicroRNA

O objetivo geral deste procedimento é realizar um experimento de microarranjo de microRNA. Isso é realizado primeiramente adquirindo lâminas de microarranjo impressas que contêm uma biblioteca de sondas de microRNA e preparando amostras de RNA com qualidade e quantidade adequadas. Em seguida, o RNA e uma amostra de DNA controlada são marcados com corantes fluorescentes.

Em seguida, os ácidos nucleicos marcados são adicionados a uma lâmina de microarranjo para hibridização. Por fim, a lâmina de microarranjo é lavada, escaneada e regenerada. Em última instância, podem ser obtidos resultados que mostram a expressão em todo o genoma de microRNAs por meio da análise da lâmina quanto às intensidades de hibridização das sondas individuais de microRNA.

Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de expressão gênica, como como condições fisiológicas normais ou condições patológicas afetam diferencialmente as necessidades de expressão de microRNAs em uma escala global. A qualidade da fabricação do microarranjo é um dos fatores mais críticos para o sucesso de um experimento com microarranjo. Após o isolamento de RNA utilizando um método que preserve os pequenos RNAs e ressuspendê-lo em uma concentração igual ou maior que dois miligramas por mililitro, marque o RNA em um volume de reação de 20 microlitros misturando inicialmente cerca de 25 microgramas de RNA total com 0,5 micrograma de P-C-U-D-Y 5 4 7 3' em tampão HEPs 1X suplementado com T four RNA Ligase 1D TT e ATP. Se houver menos RNA disponível, reduza proporcionalmente a quantidade de RNA e da reação.

Se o RNA estiver muito diluído, adicione um transportador, como levedura ou TRNA, para auxiliar na precipitação, e incube a reação em gelo dentro de uma geladeira por duas a 24 horas. Em seguida, adicione acetato de sódio até 0,3 molar e, depois, três volumes de etanol, precipitando o RNA durante a noite a 20 graus Celsius negativos. Para usar as lâminas pela primeira vez, pré-hibridize-as em uma solução filtrada de 3 XSSC, 0,1% de SDS e 0,2% de BSA por 30 a 60 minutos a 37 graus Celsius.

Em seguida, mergulhe as lâminas na água várias vezes. Depois, em isopropanol, seque as lâminas utilizando uma centrífuga com adaptador para lâminas a 100 vezes G durante cinco minutos a 22 graus Celsius. Enxágue as tiras elevadoras em água.

Em seguida, em etanol antes de secar ao ar, coloque uma lâmina dentro da base de uma câmara de hibridização de microarranjo e uma lamínula sobre a lâmina, de modo que a lamínula cubra a área da sonda e suas tiras brancas. Mantenha a lâmina em contato no escuro, centrifugue para sedimentar o RNA marcado precipitado, lave-o uma vez com etanol 70% e seque o pellet ao ar. O pellet deve apresentar coloração avermelhada.

Prepare uma solução de hibridização utilizando de um quinze avos a um centésimo em volume do DNA de referência marcado purificado por amostra de RNA. Dissolva completamente o pellet de RNA com cerca de 60 microlitros da solução de hibridização para garantir que a solução não seque. Durante a incubação, adicione 20 microlitros de água a cada um dos poços umidificadores na base da câmara de hibridização de microarranjo.

Adicione a mistura de RNA marcado e DNA de referência à lâmina. Usando uma ponteira fina, toque suavemente na borda do espaçador e, por sucção, permita que a solução entre no espaço entre o espaçador e a lâmina.

Coloque a tampa da câmara de hibridização sobre a base. Em seguida, feche a câmara com clipes metálicos. Coloque toda a câmara dentro do saco plástico que acompanha o cassete da câmara.

Por fim, coloque a cassete da câmara dentro de um recipiente com uma toalha de papel úmida. Em seguida, cubra o recipiente com filme plástico e coloque-o dentro de uma incubadora de cultura celular úmida a 37 graus Celsius por cerca de 24 horas. Para processar as lâminas após a hibridização, desmonte as cassetes da câmara uma a uma, mergulhando uma lâmina e sua plaqueta elevadora em XSSC 2 a 22 graus Celsius.

O escorregamento do elevador cairá naturalmente da lâmina; lave as lâminas duas vezes em 0,8 XSSC, depois três vezes em 0,4 XSSC, num total de um a dois minutos. Seque as lâminas utilizando uma centrífuga com adaptador para lâminas. Em seguida, escaneie as lâminas com um scanner de microarranjos e use um programa como o blue fuse para quantificar as intensidades nos arquivos de imagem.

Inspecione pontos individuais para excluir pontos anormais que geralmente surgem da impressão do lâmina com poros ou do manuseio da lâmina após a hibridização. Para análise e apresentação dos dados, utilize programas como Gene Spring e Excel para reutilizar o micromatriz. Remova o marcador lavando a lâmina em água, seguido pela imersão em um recipiente de coloração contendo NaOH pré-aquecido a um milimolar e 0,1 XSSC a 62 graus Celsius por 10 a 20 minutos.

Repita a incubação pela segunda vez. Lave as lâminas várias vezes em água por até 60 minutos com agitação suave a 22 graus Celsius. Seque as lâminas utilizando uma centrífuga e armazene a 22 graus Celsius.

As lâminas podem ser usadas sem pré-hibridização. Esta figura mostra uma imagem escaneada de um micromatriz demonstrando sinais de hibridização muito precisos e fortes. As manchas vermelhas resultaram da hibridização do DNA de referência, as manchas verdes da amostra de RNA marcada com DY 5 47, e as manchas amarelas foram provenientes da hibridização tanto do DNA quanto do RNA com as mesmas sondas.

Os coeficientes de correlação de Pearson entre réplicas técnicas de hibridização em microarranjos são de aproximadamente 0,99, indicando excelente reprodutibilidade. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar um experimento personalizado de microarranjo, não apenas para quantificar micronase, mas também para quantificar outros tipos de ácidos nucleicos, como RNAm.