Um método de genotipagem baseados em PCR para distinguir entre variedades do tipo selvagem e Ornamental de Imperata cylindrica

O principal objetivo deste procedimento é fornecer um protocolo de genotipagem molecular rápido e econômico, capaz de diferenciar entre variedades de Retta cylindrica, comumente chamada de capim-gon, que não podem ser distinguidas apenas pela morfologia. Isso é realizado primeiramente identificando e isolando tecido de uma variedade de capim-gon de interesse. O próximo passo é extrair o DNA nuclear e plastidial do tecido coletado.

Em seguida, é realizada uma reação em cadeia da polimerase no DNA extraído utilizando primers específicos para variedades que visam diferenças de sequência na região LF do PLAs, bem como controles positivo e negativo apropriados. O passo final consiste em realizar eletroforese em gel para cada uma das quatro reações de PCR, a fim de visualizar os produtos amplificados. Em última análise, a variedade de capim-gordura coletada é determinada por meio da análise das bandas de produtos de PCR específicas para variedade obtidas no gel. Plantas invasoras custam aos Estados Unidos cerca de 3,4 bilhões de dólares anualmente, causando danos substanciais aos recursos agrícolas e naturais.

A imparato Electrica do tipo selvagem, também conhecida como grama Cogan, é uma das dez piores ervas daninhas invasoras do mundo. A grama Cogan forma extensões de monocultivo que deslocam a vegetação nativa e, por consequência, os animais que dependem dessa vegetação nativa. Atualmente, a grama Cogan infesta 490 milhões de hectares em todo o mundo e cerca de 500.000 hectares nos Estados Unidos. Uma variedade ornamental de ti de tus centrica é amplamente comercializada sob os nomes de tus Centrica, Arbra, red Baren e Japanese blood crass, como também chamaremos de JBG. Essa variedade é supostamente estéril e não invasiva, sendo considerada desejável por suas folhas de cor vermelha.

Sob certas condições, a grama-sangue-japonesa pode produzir sementes viáveis e reverter para uma forma totalmente verde que é indistinguível da grama cogan selvagem. Como é possível observar, ambas possuem folhas verdes e são maiores do que a variedade ornamental tradicional, com folhas maiores. Além disso, as plantas revertidas e do tipo selvagem possuem rizomas maiores do que a variedade ornamental, aumentando seu potencial reprodutivo assexuado.

A reversão torna a identificação apenas por meio da morfologia uma tarefa difícil. Os métodos moleculares fornecem um meio para distinguir com precisão plantas invasoras e materiais vegetais que não podem ser identificados por meios visuais convencionais.

Os métodos moleculares são essenciais para proteger contra a disseminação e introdução de plantas invasoras. A aplicação deste protocolo molecular fornece um meio para distinguir com precisão os reverts da grama-sangue-japonesa da grama Kogan. Este protocolo pode ajudar a prevenir a coexistência com a grama Kogan e a possível formação de híbridos viáveis.

A principal vantagem dessa técnica em relação a técnicas existentes, como polimorfismo no comprimento de fragmentos amplificados, ou análise AFLP, e coisas como sequenciamento de DNA, é que ela fornece uma técnica de genotipagem molecular muito eficaz em termos de custo e rápida, capaz de distinguir facilmente a diferença entre o capim kogan selvagem e as variedades de capim-sangue-japonês. A demonstração da técnica será feita por Joseph Hery, um aluno de graduação do nosso laboratório. Primeiro, identifique um espécime de um local onde o capim-gon ou o capim-sangue-japonês estejam crescendo e precisem ser diferenciados um do outro.

A grama-sangue-japonesa é facilmente distinguida da grama tipo selvagem Kogan por suas folhas vermelhas brilhantes. No entanto, a reversão da grama-sangue-japonesa é quase indistinguível da grama Kogan, pois ambas possuem folhas verdes mais longas, maior área foliar e rizomas maiores do que a grama-sangue-japonesa ornamental. Este método pode ser utilizado em tecidos foliares frescos, congelados e recentemente secos.

Se os tecidos forem armazenados para extração de DNA em uma data posterior, o melhor método é congelar e armazenar o tecido imediatamente a menos 80 graus Celsius. Se o armazenamento a seco for necessário, coloque o tecido em um envelope de papel e guarde o envelope em gel de sílica desidratado ou outros dessecantes ativos à temperatura ambiente. Se o tecido fresco for utilizado, certifique-se de que o DNA seja extraído dentro de três horas após a coleta para evitar degradação.

Este procedimento utiliza o mini kit DNEZ para plantas da Kyogen, conforme as instruções do fabricante, com uma pequena modificação. O procedimento foi adaptado para utilizar mais de 100 miligramas de tecido fresco ou congelado ou mais de 20 miligramas de tecido seco. Primeiro, triture mais de 100 miligramas de tecido foliar fresco ou congelado, ou mais de 20 miligramas de tecido foliar seco, até obter um pó fino, utilizando três rodadas de nitrogênio líquido com moagem em almofariz e pistilo resfriados.

Pese o pó congelado de tecido fresco ou congelado em alíquotas de 100 miligramas. Se estiver usando tecido foliar seco, pese o pó em alíquotas de 20 miligramas. Após esta etapa, prossiga com a extração de DNA de acordo com as instruções do fabricante, utilizando um espectrofotômetro como o teste no espectrofotômetro NanoDrop, DNA, qualidade e quantidade; bons rendimentos de DNA devem estar entre 50 e 150 nanogramas por microlitro, com as razões 260/280 e 230/280 próximas de 2,0, conforme mostrado aqui.

Realize a eletroforese utilizando um gel padrão de 1% AROS. Verifique a presença de bandas relativamente grandes maiores que 10 KB, com pouca ou nenhuma manchação devido à contaminação por RNA; se a concentração de DNA for alta, dilua as amostras para 70 nanogramas por microlitro para as etapas subsequentes. Os iniciadores de PCR utilizados neste protocolo, indicados pelas setas vermelha e verde, baseiam-se nas diferenças de sequência entre a região espaçadora LF do capim-plastered e os genótipos do capim-sangue-japonês.

Essas diferenças ocorrem na forma de polimorfismos de nucleotídeo único e inserções e deleções indicadas pelas setas pretas verticais, o que permite o desenvolvimento de iniciadores específicos para cada variedade. Ao posicionar os iniciadores nos locais de sequências únicas, as sequências dos iniciadores estão contidas na parte escrita do protocolo; para cada conjunto de amostras de DNA isolado, monte duas reações de PCR de 50 microlitros em tubos de PCR de parede fina de 0,2 mililitro sobre GELO, utilizando cada conjunto de iniciadores de acordo com o protocolo escrito. Se a concentração de DNA for baixa, pode-se adicionar mais DNA a cada reação, ajustando-se a quantidade de água duplamente destilada livre de nucleases, de modo que o volume total da reação permaneça em 50 microlitros.

Não utilize mais de cinco microlitros de DNA ou 10% do volume total por reação, pois impurezas contidas nas amostras de DNA podem inibir as reações de PCR. Para garantir que todos os reagentes de PCR estejam funcionando corretamente, prepare cuidadosamente o controle positivo. Usando os primers do controle positivo, monte o controle negativo com o mesmo conjunto de primers do controle positivo, mas substitua o DNA extraído por água bidestilada. Neste ponto, haverá um total de quatro reações de PCR para cada amostra em teste. Em seguida, realize as amplificações por PCR em um termociclador equipado com tampa aquecida, utilizando os parâmetros de ciclagem de PCR descritos no protocolo escrito. Pode ser necessária a otimização da temperatura de annealing dos primers, dos tempos de extensão e do número de ciclos, dependendo da qualidade do DNA, dos primers, da polimerase ou do tipo de termociclador utilizado.

Após a conclusão das reações de PCR, separe os produtos de PCR em um gel a 1% utilizando eletroforese padrão. Execute as amostras a aproximadamente 120 volts até que a frente do corante atinja três quartos do comprimento total do gel. Visualize o gel sob luz ultravioleta e examine as bandas resultantes para verificar se um fragmento de DNA apropriado foi amplificado.

Este gel representativo mostra os resultados da eletroforese de produtos de PCR derivados de amostras de DNA de grama Kogan, grama japonesa sangrenta e reverter da grama japonesa sangrenta combinadas com iniciadores específicos para grama Kogan e JBG, bem como o controle positivo turn LF e um controle negativo sem molde. O conjunto de iniciadores do controle positivo turn LF funciona igualmente bem para grama Cogan, grama japonesa sangrenta, revertido da grama japonesa sangrenta e outras gramíneas, e resultará em uma banda de 890 pares de bases. Se todos os reagentes de PCR estiverem livres de contaminantes de DNA, a reação do controle negativo não produzirá um produto de PCR.

Se a amostra de DNA for derivada de capim kogan selvagem, uma reação de PCR utilizando o conjunto de primers específico para o capim kogan resultará em uma única banda com cerca de 595 pares de bases, enquanto os primers específicos para JBG não resultarão em nenhuma banda. Da mesma forma, se a amostra de DNA for derivada de JBG ou de uma reação J-B-G-A-P-C-R revertida, o uso do conjunto de primers específico para JBG resultará em uma única banda com aproximadamente 594 pares de bases, enquanto os primers específicos para o capim kogan não produzirão nenhuma banda.

Como JBG e JBG revertido possuem a mesma sequência de ácidos nucleicos, terão, portanto, padrões de bandas idênticos. No entanto, as diferenças morfológicas entre JBG e os reverts de JBG são bastante evidentes, de modo que, embora os resultados da PCR sejam os mesmos, as variedades de JBG são fáceis de distinguir no nível da planta. O sequenciamento de DNA dos produtos da PCR pode identificar possíveis alterações nas sequências de DNA de diferentes ecótipos de capim cogan.

O desenvolvimento desta técnica fornece o primeiro método molecular simplificado que pode distinguir com precisão entre o tipo selvagem de K e grama e a forma revertida de sua variedade ornamental, grama-sangue-japonesa. Incentivamos os usuários deste protocolo a entrar em contato conosco para relatar os resultados obtidos com o uso deste protocolo. Essas informações compartilhadas ajudarão a fornecer dados sobre a distribuição da grama-sangue-japonesa.

Isso também ajudará os reguladores do USDA a tomarem decisões informadas sobre ações que possam ser necessárias para evitar a disseminação e a hibridização potencial das variedades altamente invasivas de capim Cogan.