Protein Assay Overlay membrana: um protocolo para testar Interação entre proteínas solúveis e insolúveis In vitro

Teste de proteína. A interação proteica é indispensável para a análise da funcionalidade das proteínas. Este vídeo apresenta um ensaio de ligação proteína-proteína in vitro para testar a interação entre uma proteína de membrana imobilizada e uma proteína solúvel.

Primeiro, as proteínas de fusão são clonadas, expressas e extraídas. A proteína insolúvel marcada é imobilizada em membrana de nitrocelulose e tratada para ser renaturada em sua conformação nativa. Em seguida, a membrana é incubada com proteínas solúveis marcadas e é realizada uma análise imunológica para detectar as proteínas.

Se as proteínas marcadas interagirem, serão capturadas pela proteína imobilizada na membrana, e o sinal da imunodetecção será observado. Assim, este ensaio fornece um método confiável para testar a interação entre uma proteína insolúvel e uma proteína em solução. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como o "pull down" de GST, é que é possível avaliar com confiança a ligação entre proteína insolúvel e proteína solúvel in vitro.

O primeiro passo deste procedimento é gerar proteínas marcadas geneticamente para detecção. Comece clonando a proteína que será imobilizada na membrana. Refira-se a ela como pro Im (proteína imobilizada) em um vetor de expressão, codificando uma etiqueta grande, como GST; o vetor de expressão vazio, que codifica apenas a etiqueta, será usado como controle negativo da proteína imobilizada e é denominado pro Im nc.

Em seguida, clone a proteína que será usada como sonda solúvel em um vetor de expressão, codificando uma etiqueta diferente, como strep dois. Isso será denominado prosol para proteína solúvel como controle negativo; clone uma proteína solúvel de controle negativo no mesmo vetor de expressão. Isso será denominado Prosol NC para proteína solúvel de controle negativo.

Em seguida, utilize um sistema de expressão proteica, como *E. coli* ou vírus baculovírus, para expressar as proteínas marcadas; o sistema de expressão utilizado deve ser cuidadosamente escolhido com base na necessidade de modificações pós-traducionais. Extraia as proteínas expressas do organismo de escolha. Para pro IM e pro I mnc Resus.

Suspenda as células em tampão de carregamento para SDS-PAGE contendo coquetel de inibidores de protease. Em seguida, ferva as células por cinco minutos e, depois, centrifugue-as para remover o precipitado e extrair o Prosol e o prosol NC. Utilize procedimentos padrão. O pro IMS pode ser extraído sob condições desnaturantes porque as proteínas serão reenoveladas após serem imobilizadas na membrana de nitrocelulose.

No entanto, o prosol deve ser extraído para obter uma conformação nativa, pois será adicionado ao tampão de ligação assim que as proteínas marcadas tiverem sido extraídas. Determine a concentração das proteínas recombinantes utilizando um método padrão, como o kit de ensaio de proteína da BioRad. Caso o extrato bruto, em vez da proteína purificada, seja utilizado para o ensaio.

Estime a concentração da proteína de interesse por meio de densitometria de varredura da banda correspondente em um gel de poliacrilamida SDS corado com comassie. Utilize concentrações conhecidas de BSA como referência. Em seguida, construa a curva padrão com base nas intensidades de sinal medidas pela densitometria de varredura do BSA e calcule a quantidade de proteína contida no extrato bruto.

O próximo passo do procedimento é imobilizar o pró-Iam e o pró-IAM NC na membrana. Comece carregando um micrograma de cada extrato de pró-Iam e pró-IAM NC, em duplicata, em um gel de poliacrilamida SDS. Após a eletroforese, remova o gel das placas de vidro e coloque-o em 100 mililitros de tampão de transferência, incubando sob agitação suave por 20 minutos à temperatura ambiente.

Após a incubação, realize um western blot para transferir as proteínas para uma membrana de nitrocelulose após a transferência, permitindo que as proteínas ligadas à membrana se reorganizem. Coloque a membrana em 15 mililitros do tampão A e incube com agitação suave. Para remover o SDS residual, incube por 15 minutos à temperatura ambiente com agitação suave.

Após a incubação, remova cuidadosamente a membrana do tampão. Em seguida, coloque a membrana em 25 mililitros de tampão de desnaturação. Incube por duas horas à temperatura ambiente com agitação suave.

Durante a incubação, a membrana de nitrocelulose ficará opaca. Em seguida, utilizando pinças, transfira a membrana para 25 mililitros de TBS e incube com agitação suave por cinco minutos. Durante este passo, a membrana retorna à sua cor branca original.

Em seguida, transfira a membrana para 25 mililitros de tampão de ligação. Incube a quatro graus Celsius com agitação suave durante a noite. Em seguida, a proteína solúvel será usada para sondar a membrana em busca da proteína imobilizada.

Primeiro, prepare os tampões de hibridização diluindo de um a dez microgramas de prosol e prosol NC em tubos separados contendo 10 mililitros de tampão de ligação fresco. Em seguida, transfira o tampão para uma bolsa de hibridização. Depois, corte a membrana em duas tiras, ambas contendo pro IM e pro IAM nc.

Essas membranas serão colocadas no tampão de hibridização. Transfira cada membrana para a solução de hibridização prosol ou prosol NC e incube por 1,5 hora à temperatura ambiente com agitação suave. Remova as membranas das soluções de hibridização e lave três vezes por 15 minutos em TBS.

Para visualizar interações entre proteínas, bloquee a membrana com leite desnatado a 2,5% em TBST durante uma hora. Após a incubação, coloque as membranas bloqueadas na solução de anticorpo primário. Aqui, é utilizado o anticorpo coelho policlonal anti-strep dois.

Incubar por uma hora à temperatura ambiente com agitação suave após a incubação. Enxaguar as membranas em 20 mililitros de TBST por 15 minutos e duas vezes por cinco minutos à temperatura ambiente com agitação suave. Em seguida, colocar as membranas na solução de anticorpo secundário conjugado à HRP. Aqui, utiliza-se um anticorpo anti-IgG de coelho conjugado à HRP.

Incube por uma hora à temperatura ambiente com agitação suave. Enxágue as membranas em 20 mililitros de TBST por 15 minutos e duas vezes por cinco minutos à temperatura ambiente com agitação suave como antes; após a lavagem final em TBS, visualize a interação entre proteínas utilizando um substrato quimioluminescente HRP da Here Millipore. Im Molan Western Chemiluminescent.

O substrato de HRP é usado após o imunoblotting do prosol. Lave a membrana com TBST por 15 minutos e depois duas vezes por cinco minutos à temperatura ambiente. Em seguida, reprobe as membranas com o anticorpo primário para a marcação do pro.

Incube com o anticorpo secundário apropriado. Visualize PRO I e pro Im NNC pela detecção de quimiluminescência para validar a identidade das bandas obtidas no ensaio de sobreposição em membrana proteica. A interação entre as proteínas A e K e YFP e MP CYFP foi avaliada em células epidérmicas de tabaco utilizando o método descrito neste vídeo, conforme mostrado aqui.

Quando a complementação da fluorescência biomolecular foi avaliada, um forte sinal de YFP foi reconstruído. Esse sinal de BFC acumulou-se em corpúsculos na periferia celular, os quais são característicos de membrana plasmática, pois MP é uma proteína altamente insolúvel. Quando expressa em bactérias ou em plantas, o ensaio de sobreposição de membrana proteica foi adotado para validar essa interação.

Extratos proteicos in vitro contendo um micrograma de GST MP ou GST não fundido foram separados por eletroforese em gel de poliacrilamida-SDS, seguida por transferência eletroforética para uma membrana de nitrocelulose. Quando esses pro iams foram incubados com a nnk solúvel strep dois GST mp, apenas o GST MP, e não o GST não fundido, exibiu ligação. Além disso, quando o mesmo conjunto de pro IMS foi incubado com uma pro serra nc IE não relacionada do citoplasma de Arabidopsis, quinase de NADH marcada com strep dois, nenhuma ligação foi observada, demonstrando ainda mais a especificidade da interação A NK MP. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de reabastecer adequadamente as proteínas imobilizadas seguindo o protocolo apresentado.