Construção de um baixo orçamento Laser Sistema axotomia para estudar a regeneração do axônio em C. elegans

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar como montar e alinhar um sistema de ablação a laser para estudar a regeneração de axônios em CL gans. Isso é realizado primeiramente montando um laser, uma glândula, um polarizador Thompson, uma placa de onda semi-integral, um espelho defletor, um periscópio, um trilho e um espelho de trilho em uma placa de montagem. O próximo passo do procedimento é alinhar o feixe de laser ao feixe emergente da lente condensadora do microscópio.

Em seguida, a lente expansora do feixe a laser é montada, alinhada e posicionada para centralizar o feixe a laser e torná-lo não divergente. O passo final do procedimento é tornar o ponto de ablação a laser congruente com o foco da imagem por meio de ajustes finos. Em última análise, é possível cortar com precisão axônios de meio mícron com dano mínimo ao tecido circundante utilizando o feixe a laser limitado pela difração, quando o alinhamento XY NC for imperfeito.

A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como os lasers de femtossegundo, é que ela é relativamente barata, custando 15.000. É praticamente isenta de manutenção e permite o corte muito preciso de axônios. Embora este método possa fornecer informações sobre a regeneração de axônios em *C. elegans*, também pode ser aplicado a outros sistemas, como moscas, peixe-zebra, camundongo, sistema nervoso periférico e células *in vitro*.

Basicamente, qualquer célula que esteja a uma distância de 30 a 50 micrômetros da superfície. Comece com os componentes posicionados na matriz de contatos e fixe com parafusos o suporte do periscópio a laser e os apoios elevados do trilho. Este sistema utiliza um laser da Classe três B, que pode facilmente danificar seus olhos; portanto, por favor, leve a segurança com laser muito a sério.

Fale com alguém do seu departamento local de física sobre como trabalhar com lasers de feixe livre com segurança. Sempre durante o processo de alinhamento, ajuste o laser na potência mais baixa. Quando você olhar através dos oculares, certifique-se de que o laser esteja mecanicamente encoberto e desligado.

Agora, posicione primeiro o microscópio, alinhando-o com o eixo do trilho. Em segundo lugar, alinhe-o com o feixe de luz transmitida proveniente da lente do condensador do microscópio. Em terceiro lugar, alinhe ambas as extremidades do trilho com o feixe do condensador utilizando uma abertura ajustável ou lente fixada ao trilho.

Use um nível e macacos de laboratório para ajustar a altura do trilho antes de prosseguir. Certifique-se de que ambas as extremidades do trilho estejam alinhadas. Agora, verifique se o feixe de laser está passando através da glândula, do polarizador Thompson e da placa de meia onda, e não está atingindo as bordas desses componentes durante a rotação.

A placa de atenuação ajustará a potência do laser com todos os componentes fixados na base óptica. Ligue o laser, configure a frequência de pulso em modo contínuo de 100 e reduza a potência ao mínimo utilizando a placa de atenuação. Use um bilhete adesivo ou papel para lentes para visualizar o feixe do laser.

Agora, eleve o feixe do laser a partir da placa óptica. Ajuste e fixe sequencialmente os espelhos montados cinematicamente, partindo do laser, para direcionar o feixe até o espelho montado na extremidade do trilho elevado. Ao final, o feixe do laser deverá estar alinhado aproximadamente ao centro dos espelhos, e os espelhos deverão estar orientados em torno de 45 graus em relação ao eixo do feixe do laser antes do alinhamento do feixe do laser com o feixe de luz transmitida do microscópio.

Remova ou abra todos os filtros ND e diafragmas no módulo intermediário. Agora iniciamos o passo mais crítico para obter o corte preciso de axônios sem danos colaterais excessivos. Vamos alinhar o laser com precisão nos eixos x, y e z, com a potência de laser mais baixa possível, a fim de obter o menor ponto de ablação.

Os feixes de laser e de luz transmitida podem ser vistos simultaneamente sobre o papel. Posicione o papel próximo à porta do microscópio para começar. Agora, inicie o alinhamento do laser utilizando os ajustes grosseiros no espelho na parte superior do periscópio e no espelho na extremidade do trilho.

Coloque uma folha de papel entre a lente do condensador alinhada e a torreta de objetivas aberta. Continue usando os ajustes finos do espelho do trilho para alinhar o feixe do laser ao centro do feixe de luz transmitida maior. Agora, fixe o microscópio no lugar com grampos.

Outras etapas para avaliar o alinhamento do laser podem ser encontradas no manuscrito escrito. Devem ser instalados expansores de feixe galileanos duplos para ampliar o feixe de laser de 300 mícrons 33 vezes, preenchendo assim a abertura traseira do objetivo de 10 milímetros. Comece montando as quatro lentes nos porta-lentes.

Em seguida, fixe as lentes no trilho de modo que todas estejam no mesmo eixo óptico e exatamente ortogonais ao feixe do laser. Ligue o laser e ajuste-o à potência mínima e ao modo contínuo. Ajuste aproximadamente o alinhamento do feixe através de cada lente.

Use papel para visualizar o feixe. Agora desligue o laser. Aplique um obturador de segurança ao laser e remova o microscópio do trajeto do feixe laser.

Ligue novamente o laser e visualize-o em uma parede próxima. Use o ajuste fino das lentes para expandir o feixe. Em seguida, ajuste os dois últimos espelhos montados cinematicamente para alinhar o feixe em um círculo de brilho uniforme na posição estimada da abertura traseira do objetivo.

Observe o tamanho e a uniformidade do feixe em relação ao papel. Em seguida, ajuste o feixe para convergência zero observando como o tamanho do feixe muda quando o papel é movido para mais longe da lente. Desligue o laser e acione o obturador mecânico.

Deslize o microscópio de volta para o trajeto do feixe a laser usando os grampos fixos para definir o alinhamento correto. Substitua os grampos no lado livre do microscópio, mas não os aperte completamente. Agora ligue o laser.

Remova o obturador de segurança e gire o revólver de objetivas para uma posição aberta usando papel na platina; um feixe a laser expandido e uniforme, centrado no feixe de luz transmitida do condensador, deve ser visível. Caso não esteja centrado, centralize os feixes afrouxando as braçadeiras do microscópio e movendo cuidadosamente o microscópio. Agora, acione o obturador de segurança e configure o laser no modo de disparo.

Gire o objetivo de 60 vezes para a posição correta. Agora, visualize as arranhões na superfície de uma lâmina-alvo. Remova o obturador de segurança, dispare o laser de ablação e ajuste a potência do laser para obter o menor ponto de ablação possível.

O ponto deve ser circular e estar a cinco a dez mícrons do centro da imagem, o centro, o ponto de ablacão. Usando os ajustes finos do espelho de trilho montado cinematicamente para manter o ponto centralizado e o perfil do feixe uniforme, será necessário ajustar iterativamente o espelho montado no trilho e o espelho do periscópio superior. Avalie o foco Z do laser movendo o foco para cima e para baixo sistematicamente em passos de um mícron, acionando o laser de ablacão em cada passo.

Se o feixe estiver corretamente expandido e alinhado, com a convergência adequadamente ajustada, então deverá haver ablação máxima no foco da imagem e fraca ou nenhuma ablação, um mícron acima ou abaixo do foco. Se o ponto máximo de ablação estiver acima ou abaixo do foco da imagem, faça os ajustes finais no foco Z do feixe expandido movendo a lente L3 do telescópio galeano até que a ablação a laser coincida com o foco da imagem. Os nematoides foram montados em uma lâmina personalizada e os axônios foram ablacionados usando o sistema construído de laserexosomia, e a microscopia com imagens de tempo real da regeneração axonal foi muito robusta.

Usando uma platina motorizada, foi possível cortar e imaginar rotineiramente cinco axônios em cinco animais diferentes em um único lâmina. O tempo de aquisição de imagens para os axônios foi o fator limitante.

Cerca de 10% dos experimentos produziram filmes de lapso de tempo de alta qualidade. Os experimentos restantes forneceram todos dados bons, mas eram esteticamente menos atraentes devido a pequenos movimentos de tremor do verme que geralmente começavam após cinco a oito horas de imobilização. Ao tentar este procedimento, é sempre importante avaliar com precisão o alinhamento do laser nos eixos x, y e Z.

O problema mais comum que as pessoas enfrentam ao tentar cortar axônios é o dano colateral ou a incapacidade total de cortar axônios, e isso quase sempre se deve a um laser desalinhado. Este sistema de ablação a laser e a técnica para visualizar a regeneração de axônios em c Agains permitirão que você analise rotineiramente o efeito de qualquer mutação genética na regeneração de axônios. NCL Agains.