Construindo um hidrogel de colágeno para a entrega de células-tronco carregado microesferas

Este protocolo oferece uma estratégia in vitro para entregar células-tronco a partir de microesferas de quitosana em um suporte de gel de colágeno, colher e cultivar. As células-tronco adipocitárias primárias emulsionam e recuperam então uma preparação de microesferas de quitosana. Em seguida, semeiam-se as células-tronco nas microesferas de quitosana e cultivam-se em um inserto de placa de cultura com membrana de oito mícrons de tamanho de poro para produzir um CSM carregado com CS; finalmente, mistura-se o sistema de liberação por microesferas com um suporte tridimensional de gel de colágeno.

No fim das contas, este sistema de MTC oferece potencial para uso em medicina regenerativa e entrega de fármacos. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como injeção de células ou microencapsulação, é a capacidade das células de se ligarem a um material transportador e persistirem após a aplicação inicial. Geralmente, indivíduos novos nesta técnica terão dificuldades porque as microesferas de esan possuem uma carga estática intrínseca.

E carregar as células sobre uma cama de microesferas será desafiador sem perturbá-las. Excise e lave o tecido adiposo perineal e epidérmico de um fragmento, pique o tecido, depois transfira um a dois gramas para 25 mililitros de HBSS contendo 1% de FBS. Após a centrifugação, colete a camada de tecido adiposo livre em um frasco erlenmeyer de 125 mililitros.

Adicione 25 mililitros de colagenase tipo dois e incube a reação em um agitador orbital. Agora, remova cuidadosamente a fração líquida abaixo da camada de óleo e tecido adiposo e filtre sequencialmente por meio de filtros de malha de náilon de 170 mícrons. Recolha as células por centrifugação após duas lavagens com 25 mililitros.

HBSS Resus, suspenda o pellet em 30 mililitros de meio de crescimento Mesen Pro suplementado. Divida as células-tronco derivadas de adipócitos purificadas em dois frascos de cultura T 75 e amplifique a preparação de CTA em um incubador umidificado com 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius. Este protocolo de CSM é um processo de emulsificação água em óleo que utiliza uma técnica iônica coerente.

Emulsifique seis mililitros de uma solução aquosa de quitosana em 100 mililitros de uma mistura da fase oleosa utilizando agitação magnética e agitação superior simultaneamente em direções opostas durante uma hora até obter uma emulsão estável de água e óleo; adicione 1,5 mililitro de hidróxido de potássio 1% em n-octano a cada 15 minutos durante quatro horas. Após a conclusão da reação de reticulação iônica, decante lentamente a fase oleosa e adicione imediatamente as esferas a 100 mililitros de acetona. Lave as esferas com acetona até que a fase oleosa seja completamente removida.

Em seguida, seque as esferas recuperadas em vácuo. Desseque e determine o tamanho médio das partículas de CSM, a área superficial por miligrama e o volume cúbico unitário utilizando um analisador de tamanho de partículas. Prossiga para lavar o CSM três vezes com água estéril para remover sais residuais.

Agora, esterilize a preparação de CSM com álcool absoluto para uso em experimentos celulares em um tubo de vidro de 50 mililitros, misture cinco miligramas de microesferas com um mililitro de solução de TNBS 0,5% e incube por quatro horas a 40 graus Celsius. Em seguida, adicione três mililitros de ácido clorídrico seis normal e incube a 60 graus Celsius por duas horas. Após resfriar as amostras à temperatura ambiente, adicione cinco mililitros de água deionizada e 10 mililitros de éter etílico.

Para extrair o TNBS livre, retire uma alíquota de cinco mililitros da fase aquosa e aqueça a 40 graus Celsius em banho-maria por 15 minutos para evaporar qualquer éter residual após o resfriamento à temperatura ambiente. Dilua com 15 mililitros de água e, com um espectrofotômetro, meça a absorbância das microesferas de quitosana preparadas a 345 nanômetros, utilizando TNBS como branco.

Também meça a quitosana utilizada na preparação do CSM. Agora, calcule o número de grupos amino livres do CSM em relação ao número total de grupos amino na quitosana. Equilibre cinco miligramas do CSM esterilizado em HBSS estéril durante a noite.

Transfira o MCT para um inserto de membrana de oito mícrons para placas de cultura de 24 poços. Após o assentamento do MCT, aspire cuidadosamente o HBSS. Em seguida, adicione 300 microlitros de meio de crescimento no interior do inserto e 700 microlitros de meio de crescimento no exterior do inserto. Resus.

Suspenda as células-tronco derivadas de adipócitos em 200 microlitros de meio de crescimento e semeie sobre a MTC dentro da placa de cultura. Incube por 24 horas em um incubador umidificado com 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius. Transfira a MTC carregada com CTA para um tubo de microcentrífuga estéril sem perturbar as células que migraram para a membrana do inserto.

Agora remova o meio residual e adicione 250 microlitros de meio de crescimento fresco a cada tubo. Adicione 25 microlitros de solução de MTT a cinco miligramas por mililitro e incube por quatro horas. Remova os meios e adicione 250 microlitros de dimetil sulfóxido, vortexe para solubilizar o complexo formazan; centrifugue o CSM a 2.700 ×g por cinco minutos.

Meça a absorbância do sobrenatante a 570 nanômetros usando 630 nanômetros como referência. Prossiga para determinar o número de células associado ao CSM em relação ao valor de absorbância obtido a partir de números conhecidos de A SC viáveis. Misture cinco miligramas de um CSM carregado com SC com 7,5 miligramas por mililitro. Colágeno do tipo um extraído de rato.

Tendão da cauda, ajuste o pH para 6,8 utilizando hidróxido de sódio 2 N e despeje em uma placa de cultura. Insira para fibrilar e, agora, transfira para uma placa de 12 poços e incube por 30 minutos. Continue a renovar o meio para os géis de colágeno A-S-C-C-S-M a cada dois dias durante o período de incubação.

Também monitore a liberação e migração de células do CSM para o gel utilizando técnicas padrão de microscopia. Este exemplo a seguir descreve a estratégia in vitro para entregar células-tronco derivadas de adipócitos a partir de microesferas de quitosana para um suporte tridimensional de gel de colágeno. Imagens de MEV e MET indicam uma preparação de CSM poroso de tamanho uniforme.

A incubação das microesferas com células-tronco derivadas do tecido adiposo primárias indica 4.000 células por miligrama de CSM de cálcio am. A coloração de uma SC mostra espalhamento sobre o CSM com prolongamento de filopódios nas fendas porosas da microesfera. Quando os CSM carregados com células foram misturados ao gel de colágeno, as células migram para o interior do gel e podem ser acompanhadas ao longo do tempo.

As implicações dessa técnica estendem-se imediatamente para a terapia da perda tecidual maciça e crônica. No entanto, esse regime de tratamento possui muito mais potencial devido à sua versatilidade em integrar-se com uma variedade de células e/ou biomateriais utilizados para tratar diferentes níveis de perda de tecidos moles e cardíacos. Dúvida de que este método possa fornecer informações sobre a entrega de células hospedeiras.

Também pode ser aplicado a outros sistemas, como injetáveis, para liberar medicamentos terapêuticos, ou para desenvolver sistemas híbridos que liberem simultaneamente células e medicamentos terapêuticos.