Detecção de multiplex de bactérias em amostras clínicas e Complexo Ambiental utilizando Oligonucleotídeos-coupled microesferas fluorescentes
23 de outubro de 2011
Nós descrevemos um método multiplex para a detecção de microorganismos em uma amostra usando oligonucleotídeos-coupled partículas fluorescentes. Amplicon de todos os organismos dentro de uma amostra é hibridizada com um painel de sonda acoplada contas. Um instrumento Luminex ou Bio-Plex é usado para consultar cada grânulo para o tipo de grânulo e sinal de hibridização.
Olá, sou Tim Duso da Agricultura e AgriAlimentos do Canadá. Neste vídeo, demonstraremos um protocolo para determinar a presença e abundância de microrganismos específicos em uma amostra clínica ou ambiental complexa, utilizando um instrumento Bio-Plex. Este protocolo utiliza microesferas de poliestireno fluorescentes que são quimicamente ligadas a uma sonda de oligonucleotídeo específica para a espécie.
Um amplicon é gerado a partir da amostra usando primers universais de PCR e o amplicon é hibridizado com as microesferas conjugadas a sondas. Dois sinais são gerados com o instrumento Bio-Plex. Um identifica a microesfera e o outro quantifica o sinal de hibridização.
O objetivo geral do procedimento é determinar um perfil da microbiota de interesse de forma rápida e semiquantitativa. Aplicamos esta técnica para determinar perfis bacterianos em swabs vaginais e utilizamos os dados gerados para diagnosticar a vaginose bacteriana, uma condição clínica caracterizada por uma alteração na microbiota, na qual organismos do gênero Lactobacillus tornam-se menos prevalentes e outros organismos, como Gardnerella, Vais e Apoian Vae, passam a ser detectáveis em swabs vaginais. É importante ter em mente, no entanto, que esta técnica pode ser aplicada a qualquer outra microbiota para a qual seja desejável um ensaio multiplex rápido.
Vamos começar descrevendo como o procedimento funciona. Um perfil microbiano é gerado pela amplificação de uma proteína e do gene do chaperone 60 de todos os organismos presentes em um extrato de DNA do swab. Um dos primers de amplificação universal é modificado pela adição de biotina, bem como pela inclusão de bases modificadas com fosfato.
Na extremidade cinco prime, o amplicon é tornado fita simples usando a exonuclease T sete, que degrada apenas a fita antissenso. Como a fita sentido é protegida por um iniciador de PCR modificado com fosfato, sondas oligonucleotídicas complementares à fita remanescente são ligadas covalentemente a microesferas fluorescentes de poliestireno. Com cada cor única de microesfera contendo uma sonda que detecta um organismo diferente, até cem microesferas distintas podem ser utilizadas para uma única amostra.
O produto PCR de fita simples proveniente do swab vaginal é hibridizado a uma mistura de microesferas acopladas a sondas, contendo sondas para todos os organismos de interesse. Um marcador fluorescente FICO etin é adicionado, que se liga às sondas biotiniladas por meio de um conjugado estreptavidina. Por fim, a mistura de hibridização é analisada em um instrumento Luminex ou Bio-Plex, que examina individualmente cada microesfera quanto à identidade e ao sinal de hibridização.
Os resultados dessa análise indicam a presença de microrganismos específicos e a intensidade do sinal de hibridização correlaciona-se com a abundância desse organismo. Na amostra, a presença de organismos relacionados à VB pode ser utilizada para diagnosticar a VB. A principal vantagem dessa técnica em relação a métodos existentes, como a coloração de Gram, é que são geradas informações sobre a presença de microrganismos específicos e sua abundância.
Quem demonstrará o procedimento será Jennifer Town, uma assistente de pesquisa em nosso laboratório. Re-suspenda as microesferas por meio de vortex por aproximadamente 20 segundos. Transfira 400 microlitros de microesferas para um tubo Eppendorf e centrifugue a 14.000 × g por um minuto, remova e descarte o sobrenadante. Suspenda as microesferas em 50 microlitros de MES 0,1 molar, pH 4,5.
Adicione um animo do oligo de captura às microesferas e misture por vortex. Adicione 2,5 microlitros de solução fresca de EDC às microesferas. Incube a reação à temperatura ambiente por 30 minutos no escuro.
Descarte a solução de EDC preparada anteriormente e prepare uma nova amostra de 10 miligramas por mililitro de EDC em água. Como acima, adicione mais 2,5 microlitros da solução fresca de EDC aos microesferas e vortex por cinco segundos. Incube novamente à temperatura ambiente por 30 minutos no escuro.
Lave as esferas adicionando um mililitro de Tween 20 a 0,02%, vortexando para ressuspender as esferas e centrifugando a 14.000 × g por um minuto; remova e descarte o sobrenadante. Lave as esferas novamente adicionando um mililitro de SDS a 0,1%. Ressuspenda as esferas em 100 microlitros de tampão TE.
Conte as microesferas em um hemocitômetro para determinar a concentração estoque. Prepare uma mistura-mestre de microesferas diluindo cada microesfera para uma concentração final de 100 microesferas por microlitro no tampão TE. Reúna as microesferas conjugadas de acordo com o plexo desejado do ensaio. Armazene a mistura-mestre de microesferas a quatro graus Celsius, no escuro. Esta mistura pode ser armazenada por meses se mantida nessas condições. Gere o produto de PCR para cada amostra.
Inclua imediatamente o conjunto de primers modificado com fosfato e biotina na extremidade cinco prima após a conclusão da PCR. Adicione dois microlitros de exonuclease T7 a cada tubo de PCR e incube à temperatura ambiente por 40 minutos. Ao final dessa incubação, adicione 12,5 microlitros de E-D-T-A 0,5 molar, pH 8,0, e misture.
Isso resulta em um total de aproximadamente 64,5 microlitros de produto de PCR de fita simples. Resuspenda o mix mestre de microesferas com uma pipeta. Distribua uma quantidade apropriada em um tubo einor.
Tampe o tubo e sonique em banho ultrassônico por dois minutos. Dispense 17 microlitros do produto de PCR de fita simples nos poços apropriados de uma placa de 96 poços de perfil baixo e adicione 33 microlitros da mistura de microesferas ressuspendidas e sonicadas a cada um.
Cubriremos a placa com uma tampa de silicone e batemos levemente. Coloque cuidadosamente a placa no termociclador com um programa de 95 graus por cinco minutos, 60 graus por 10 minutos, retenção ou pausa a 60 graus por cinco minutos. Fim, inicie o programa.
Prepare uma solução fresca de strep Aden FICO Ethin. Serão necessários 25 microlitros por poço. Prepare strep e FICO ethin diluindo o talo a um miligrama por mililitro.
Uma em 50 a 20 microgramas por mililitro com tampão tmac uma vez. Quando o termociclador atingir a etapa de retenção a 60 graus, abra a tampa, remova a cobertura de silicone e adicione a solução de estreptodin FICO etina diretamente a cada poço. Substitua a cobertura de silicone, feche a tampa do termociclador e retome o programa.
Quando o programa estiver concluído, retire a placa e transfira-a rapidamente para a máquina Bio Plex para leitura. A leitura da placa deve ser realizada dentro de 10 minutos. Leia a placa a 60 graus.
Certifique-se de que o bio plex foi pré-aquecido a esta temperatura. Isso mostra os resultados das colorações de Gram e perfis Luminex correspondentes de amostras longitudinais de um único indivíduo no tempo zero. A coloração de Gram é compatível com um diagnóstico clínico de BV, e isso é corroborado por um ensaio Luminex Fiveplex que mostra sinais positivos de hibridização para organismos associados à BV, incluindo Gardner Relic, vais e Apoian Vae.
Lactobacillus iners também é detectado em níveis baixos à medida que o tempo avança. Esse indivíduo apresenta transição de uma microbiota associada à vaginose bacteriana (BV) para uma microbiota normal, conforme demonstrado pelas colorações de Gram. A análise por Luminex dessas mesmas amostras mostra que a abundância de Gardnerella vaginalis atinge um pico e depois diminui, enquanto Lactobacillus iners aumenta até se tornar o organismo dominante no último ponto temporal.
Usando este método para perfis da microbiota, obtém-se informações sobre a presença de organismos específicos, bem como sua abundância. Como o método é baseado em sequência, o desenho da sonda pode ser orientado por análises de sequenciamento profundo, e microrganismos identificados por métodos de sequenciamento de nova geração podem ser monitorados em amostras de forma rápida e com custo relativamente baixo. Assistir a este vídeo deve ter lhe dado uma boa compreensão de como gerar um perfil microbiano a partir de uma amostra utilizando um instrumento Luminex ou Bio Plex.
Mostramos como acoplar sondas de oligonucleotídeos às microesferas fluorescentes, gerar alíconos de fita simples a partir de uma amostra clínica ou ambiental, realizar a hibridização e determinar os resultados em um instrumento Luminex ou Bio Plex. Boa sorte com seus experimentos.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo para detecção de microrganismos em amostras complexas utilizando esferas fluorescentes acopladas a oligonucleotídeos. O método emprega um instrumento Bio-Plex para analisar os sinais de hibridização provenientes das esferas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Microbiologia
- Diagnóstico clínico
- Ciência ambiental
Antecedentes
- A detecção de microrganismos é crucial em diversas áreas.
- Os métodos tradicionais podem ser demorados e menos específicos.
- Este método aumenta a especificidade e a sensibilidade.
- As microesferas fluorescentes permitem capacidades de multiplexação.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método rápido e eficiente para detecção de microrganismos.
- Utilizar sondas de oligonucleotídeos para obter especificidade.
- Demonstrar a aplicação do instrumento Bio-Plex neste contexto.
Métodos Utilizados
- Uso de microesferas de poliestireno fluorescentes acopladas a sondas específicas para espécies.
- Geração de amplicons utilizando primers universais de PCR.
- Hibridização de amplicons com microesferas acopladas a sondas.
- Análise do tipo de microesfera e do sinal de hibridização utilizando um instrumento Bio-Plex.
Resultados Principais
- Detecção bem-sucedida de múltiplos microrganismos em um único ensaio.
- Quantificação dos sinais de hibridização demonstrada.
- Protocolo validado para amostras clínicas e ambientais.
- Elevada especificidade e sensibilidade alcançadas com o método.
Conclusões
- O método multiplex é eficaz para a detecção de microrganismos.
- A utilização de sondas de oligonucleotídeos aumenta a especificidade.
- O instrumento Bio-Plex é uma ferramenta valiosa para esta análise.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A detecção multiplex utilizando microesferas fluorescentes conjugadas com oligonucleotídeos permite o perfilamento rápido e semi-quantitativo de comunidades microbianas complexas em amostras clínicas e ambientais. Esta abordagem aumenta a confiança preditiva em diagnósticos microbianos ao fornecer resolução em nível de espécie e dados de abundância, apoiando pontos críticos de inflexão na pesquisa translacional e no desenvolvimento de ensaios. Sua escalabilidade e adaptabilidade posicionam-na como uma plataforma reutilizável para vigilância microbiana abrangente e validação de alvos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação de alterações na comunidade microbiana relevantes para mecanismos de doenças e testes de hipóteses terapêuticas.
- Apoia a validação funcional de alvos mediante a quantificação da abundância de organismos específicos em amostras complexas.
- Facilita a redução de riscos biológicos por meio da detecção de alta especificidade de táxons clinicamente relevantes.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Prepara sistemas validados e multiplexados de detecção para fluxos de trabalho diagnósticos e de triagem posteriores.
- Fornece perfis microbianos padronizados, reprodutíveis e semiquantitativos para comparação de ensaios.
- Permite expansão escalonável para detectar até 100 organismos por amostra, apoiando a reutilização da plataforma.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se com estratégias translacionais de biomarcadores ao acompanhar longitudinalmente alterações microbianas associadas à doença.
- Proporciona continuidade desde a descoberta até a validação pré-clínica, permitindo o design rápido de sondas baseado em sequências.
- Reduz a ambiguidade mecanicista em modelos de doença ao fornecer dados de abundância específicos para cada organismo.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Esta plataforma multiplexa integra desde a descoberta inicial até a identificação de compostos promissores e a pesquisa translacional, apoiando a análise microbiana orientada por hipóteses e a prontidão de ensaios.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias ao caracterizar a composição e abundância da microbiota.
- Triagem: Fornece resultados quantitativos e reprodutíveis para comparações confiáveis entre amostras e condições.
- Análises: Oferece a intensidade do sinal de hibridização como leitura quantitativa da abundância de organismos.
- Pesquisa Translacional: Permite o acompanhamento longitudinal de biomarcadores microbianos relevantes para doenças.
- Reutilização Empresarial: Adaptável a diversos tipos de amostras e alvos microbianos, apoiando ampla utilidade em P&D.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e a validação de alvos ao permitir a detecção em nível de espécie em amostras complexas.
- Valor Operacional: Padroniza e amplia o perfilhamento microbiano multiplex para aplicações de alto rendimento.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir ou não prosseguir e reduz riscos em fases avançadas ao fornecer dados microbianos acionáveis.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de programas diagnósticos e terapêuticos voltados a condições associadas ao microbioma.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência no design de sondas moleculares e em fluxos de trabalho baseados em PCR.
- Necessita de acesso a instrumentação Luminex ou Bio-Plex e infraestrutura analítica.
- Exige padronização entre equipes quanto aos conjuntos de sondas e condições do ensaio para garantir reprodutibilidade.
- Adaptável a diferentes tipos de amostras clínicas e ambientais mediante personalização adequada das sondas.
- Limitado pela necessidade de informações de sequência para orientar o design das sondas e pela possibilidade de reatividade cruzada em comunidades altamente diversas.
