Câmara de placas paralelas de fluxo e Circuito de fluxo contínuo para avaliar células progenitoras endoteliais sob estresse de cisalhamento Fluxo Laminar

O objetivo geral deste artigo em vídeo é descrever uma técnica para submeter células aderentes a condições de fluxo laminar e avaliar a resposta a tensões cisalhantes do fluido bem quantificáveis. Isso é realizado primeiramente montando o circuito de fluxo sem a câmara de fluxo. O circuito inclui o pulso do reservatório, amortecedor de pulsação, tubos rígidos, tubos flexíveis, torneiras de quatro vias e conectores tipo lure acoplados, bem como um filtro de ar.

O próximo passo é preencher o circuito com o fluido desejado, como meio celular, em condições estéreis, e então iniciar a bomba para encher o amortecedor de pulso e remover o ar dos tubos. Em seguida, insere-se a lâmina com as células na placa inferior da câmara de fluxo. O passo final do procedimento é a montagem completa do circuito de fluxo, com a câmara de fluxo conectada em linha.

Resultados finais podem ser obtidos demonstrando o alinhamento de células progenitoras endoteliais marcadas com fluorescência sob exposição a tensão cisalhante do fluido, por meio de uma câmara transparente utilizando microscopia de fluorescência. Para estudar o comportamento funcional das células, é frequentemente necessário imitar a fisiologia in vivo submetendo as células à tensão cisalhante do fluido. Nós desenvolvemos uma câmara de fluxo com placas paralelas e um circuito de fluxo contínuo, que nos permitem estudar as células sob condições de fluxo e observá-las através da câmara transparente.

Essa técnica pode servir como uma ferramenta de pesquisa valiosa para as áreas de medicina e engenharia. Nossa câmara de fluxo permite a visualização intermitente ou em tempo real de células sob fluxo, utilizando microscópio ereto ou invertido. Além disso, o design do Dr. Ach Nick permite aos pesquisadores imaginar células em superfícies transparentes ou radiopacas usando lentes de microscópio padrão.

Além disso, pode ser uma ferramenta importante na pesquisa farmacológica para estudar o efeito de fármacos sobre células sob condições de fluxo. A visualização da montagem é fundamental, pois várias das etapas são difíceis de dominar apenas lendo um protocolo. Vou fornecer instruções passo a passo sobre como montar a câmara de fluxo e o circuito de fluxo comumente utilizados no laboratório do Dr. Ock Next para montar o circuito de fluxo.

Inicie conectando um segmento de tubo rígido de 36 polegadas a uma extremidade de um amortecedor de pulso e a outra extremidade. Conecte um segmento de tubo flexível de 18 polegadas. Coloque um adaptador macho de encaixe de um oitavo de polegada na extremidade do trecho de tubo flexível de 18 polegadas.

Conecte a isca macho a um adaptador fêmea de um oitavo de polegada. Prenda a isca fêmea a um novo segmento de 18 polegadas de tubo flexível. Faça três furos em uma tampa de béquer de vidro de 250 mililitros.

Para acomodar a tubulação, insira um segmento de 1,5 polegada de tubo flexível em um dos orifícios, como saída de ar. Insira as extremidades livres dos tubos rígido e flexível pelos outros dois orifícios na tampa, dentro do frasco de vidro de 250 mililitros, que funcionará como reservatório.

Certifique-se de que o tubo rígido alcance o fundo do reservatório. A manutenção da esterilidade durante toda a montagem do circuito é crucial para o sucesso deste procedimento. Portanto, todas as partes devem ser esterilizadas e você deve usar luvas estéreis durante todo o processo.

Além das peças montadas, essas peças devem ser esterilizadas. Uma câmara de fluxo completa, três segmentos de tubo flexível de dois polegadas, um macho e um fêmea, um adaptador de encaixe de um oitavo de polegada, quatro parafusos cabeça chata de meia polegada, 6 5 16 polegadas, oito de 30 segundos. Trilhos por polegada, parafusos cabeça chata, um par de pinças, uma lâmina de vidro e duas toalhas esterilizadas por vapor.

Autoclavagem a 121 graus Celsius por 60 minutos. Coloque o circuito de fluxo, a câmara de fluxo e as torneiras de passagem quatro por quatro, uma a uma, a torneira de passagem e todas as peças esterilizadas sobre este campo estéril. Usando luvas estéreis, conecte as duas torneiras de passagem de quatro vias.

Coloque tampas nos orifícios abertos das amostras. Desconecte os adaptadores macho e fêmea que prendem os dois segmentos de tubo flexível do circuito de fluxo e insira as torneiras conectadas. Conecte o tubo flexível inserido no reservatório a uma seringa de 30 mililitros e remova o êmbolo da seringa.

Encha o frasco com 125 mililitros de meio EPC. Reconecte o tubo flexível à torneira de fechamento. Coloque um filtro de seringa estéril na ventilação de ar.

Agora transfira o circuito de fluxo para uma estufa umidificada a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono. Prenda o tubo rígido na cabeça da bomba peristáltica Master Flex indicada para uso com este tipo de tubo Palmer de carvão. Certifique-se de que o tubo não sobreponha as trilhas de montagem da bomba peristáltica.

Marque o tubo no ponto em que ele sai da cabeça da bomba em ambos os lados com uma caneta marcadora. Após garantir que todas as torneiras de fechamento estão fechadas em direção às portas de amostra e abertas ao longo do circuito de fluxo, ligue a bomba. Verifique o sentido do fluxo.

O PERFUSE oito deve fluir desde o reservatório de vidro através do tubo rígido até o amortecedor de pulso. Para a montagem da câmara de fluxo, utilize luvas estéreis para conectar um segmento de tubo flexível de dois polegadas a um adaptador fêmea de um oitavo de polegada. Conecte outro segmento de tubo flexível de dois polegadas a um adaptador macho de um oitavo de polegada.

Conecte o tubo macio de duas polegadas com adaptador fêmea tipo lure à porta de entrada e o tubo macio de duas polegadas com adaptador macho tipo lure à porta de saída. Conecte torneiras de quatro vias a ambos os adaptadores tipo lure. Conecte o pedaço restante de tubo macio de duas polegadas ao conector da porta lateral proveniente do captador de bolhas e fixe uma torneira de sentido único utilizando pinças estéreis.

Remova a lâmina com células semeadas do recipiente de cultura celular e coloque-a na reentrância da placa inferior da câmara de fluxo. Certifique-se de que a lâmina seja posicionada com o lado contendo as células voltado para cima; utilizando uma seringa ou pipeta, adicione 10 mililitros de meio EPC aquecido sobre a lâmina com células. Deixe o meio cobrir a lâmina dentro da câmara de fluxo, mas evite derramar o meio sobre a junta de vedação (O-ring) na placa inferior.

Coloque a placa superior da câmara de fluxo sobre a placa inferior, alinhando os orifícios dos parafusos. Mantenha as duas placas paralelas para não introduzir bolhas de ar na câmara ao parafusar as placas. Usando uma chave de fenda automática operada por bateria, desaerar o coletor de bolhas de entrada abrindo a válvula de retenção unidirecional conectada à porta do coletor de bolhas do lado de entrada.

Use uma seringa de 10 mililitros para lavar suavemente o tubo de entrada com o meio EPC e, em seguida, feche esta torneira de fechamento e coloque a tampa. Agora, remova o ar do canal da câmara abrindo a torneira de quatro vias da saída e lavando suavemente o meio EPC através da câmara de fluxo. Novamente usando uma seringa de 10 mililitros, tampe todas as conexões da torneira de quatro vias e feche-as.

Transfira a câmara de fluxo para o incubador umidificado com o circuito de fluxo montado. Pause a bomba do circuito de fluxo para fechar o circuito. Feche as torneiras no sentido do fluxo para evitar vazamentos.

Conecte a câmara de fluxo ao circuito de fluxo. Após a câmara de fluxo ter sido conectada ao circuito de fluxo, abra as torneiras no sentido do fluxo. Retome a bomba de fluxo e certifique-se de que o PERFUSE eight flua no sentido correto. Ajuste a taxa de fluxo ao estresse cisalhante desejado.

Durante o experimento de fluxo, a câmara de fluxo pode ser removida do circuito para visualizar as células por microscopia de luz ou fluorescente. Para isso, desconecte a câmara de fluxo do circuito de fluxo nas conexões da torneira de passagem. Para coletar o perfusato, oito amostras para análise.

Primeiro, pare a bomba e feche a torneira de fechamento localizada mais próxima ao amortecedor de pulso. Remova sua tampa protetora, colocando-a de cabeça para baixo para garantir que não seja contaminada. Insira uma seringa pequena no orifício de amostragem.

Feche a torneira de fechamento no sentido da câmara de fluxo, mantendo o orifício de amostragem e o circuito no sentido do amortecedor de pulso abertos. Aspire a quantidade desejada de amostra do circuito, feche a torneira em direção ao orifício de amostragem antes de remover a seringa. Armazene a amostra abundante oito em um frasco identificado e congele a menos 80 graus Celsius.

Tampe o portão da amostra e certifique-se de que todas as torneiras de passagem estejam abertas antes de iniciar o fluxo. Com este método, células progenitoras endoteliais derivadas de sangue humano podem ser semeadas em lâminas de titânio em até 15 minutos e aderem sob forças de cisalhamento fisiológicas. Conforme mostrado nesta figura, as CPEs se espalham sob a influência do fluxo, passando de cerca de 210 micrômetros quadrados imediatamente após a semeadura para cerca de 657 micrômetros quadrados após três horas e cerca de 1.152 micrômetros quadrados após 48 horas de estresse de cisalhamento de fluido de 15 dina por centímetro quadrado.

Esta imagem de microscópio óptico ilustra a orientação aleatória de EPCs humanas. Após um período de adesão estática de seis horas após três horas de fluxo a 100 dines por centímetro quadrado, as células se espalharam, mas permanecem em orientação aleatória. Após 48 horas de estresse por cisalhamento do fluido a 100 dines por centímetro quadrado, as EPCs estão alinhadas e orientadas na direção do fluxo.

Aqui, as EPCs foram marcadas com CTO e os núcleos celulares corados com herx para morrer após o fluxo. Para comparação, esta imagem mostra EPCs suínas em lâminas de titânio alinhadas com a direção do fluxo. Após 48 horas de fluxo e exposição a 15 dines por centímetro quadrado de tensão de cisalhamento, as bordas celulares foram coradas com anticorpo anti-pcam e os núcleos com corante de ácido nucleico citoxina.

Este método também permite obter amostras do PERFUSE oito em pontos de tempo predeterminados para a análise e/ou quantificação de metabólitos celulares secretados. Aqui é apresentado um exemplo da produção de nitrito durante um experimento de fluxo de 48 horas com EPCs suínos. Ao realizar este procedimento, é importante manter a esterilidade durante todo o processo.

Além disso, é importante tomar as medidas necessárias para reduzir o número de bolhas de ar na câmara de fluxo antes do início do fluxo contínuo, pois elas podem destacar as células. Também recomendamos verificar cada conexão individual na câmara de fluxo e no circuito antes da perfusão para evitar vazamentos do PERFUSE eight durante um experimento. Esta câmara é projetada com anéis O integrados que permitem o perfeito alinhamento das placas superior e inferior e fornecem um selo à prova de vazamentos, sem necessidade de bombas de vácuo.

Este recurso também garante uma altura constante da câmara entre experimentos e elimina a necessidade de juntas de borracha ou ajustes. Nossa câmara de fluxo utiliza lâminas de microscópio padronizadas. Assim, um grande número de células está disponível para experimentos adicionais.

Por exemplo, o RNA e o DNA de células após o fluxo podem ser avaliados quanto à síntese proteica ou à expressão gênica. O nosso design de circuito permite a coleta de oito amostras para análise e quantificação de metabólitos celulares, como o nitrito, um metabólito oxidativo primário do óxido nítrico, que é secretado pelas células sob estresse por cisalhamento do fluido. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como montar nossa câmara de fluxo e o circuito de fluxo estéril para submeter células aderentes ao estresse por cisalhamento do fluido.