Visualização de Caenorhabditis elegans Estruturas cutícula Usando o Dye lipofílicos Vital, DII
30 de janeiro de 2012
Nós apresentamos um método para visualizar cutícula ao vivo C. elegans Usando o corante vermelho fluorescente lipofílico DII (1,1 '-dioctadecyl-3, 3,3', 3'-tetramethylindocarbocyanine perclorato), que é comumente usado em C. elegans Para visualizar os neurônios expostos ambientalmente. Com este protocolo otimizado, asa e anular estruturas cuticulares estão manchadas pelo DII e observados através de microscopia composto.
O objetivo geral deste procedimento é visualizar a cutícula em peixes-zebra transparentes vivos utilizando o corante lipofílico fluorescente vermelho dye eye. Isso é realizado preparando uma população de nematodos para coloração. Em seguida, o dye eye diluído é adicionado à população e os organismos são deixados em incubação.
Em seguida, os animais são recuperados da solução de coloração. A imagem de fluorescência da cutícula corada com Dai mostra detalhes na superfície, incluindo estruturas reprodutivas dos olhos Ailey e Ann e outras características morfológicas externas. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes para visualização da cutícula neste organismo transparente, como imagem direta, fluorescência, expressão de transgene, coloração com anticorpos, microscopia eletrônica e aglutinina de trigo germinado marcada, é que esta técnica é fácil de realizar, relativamente rápida e econômica, e fornece uma resolução belíssima das estruturas cuticulares em animais vivos.
Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais em diversas áreas que utilizam o sistema modelo *C. elegans* e sua cutícula, como secreção celular e organização da cutícula, desenvolvimento de células epidérmicas, vias gênicas heterocrônicas, imunidade inata, desenvolvimento de características morfológicas e evolução de nematoides. O procedimento será demonstrado por Robbie Schultz, aluno de pós-graduação do meu laboratório. Ao trabalhar com *C. elegans*, tenha em mente que ele é sensível à luz.
Proteja sempre o olho D da luz envolvendo-o em folha de alumínio. Use também luvas e jaleco laboratorial, pois o DMF é tóxico e o DAI é um car. O cianeto Dai é muito potente.
Uma diluição de trabalho com concentração padrão é de 30 microgramas por mililitro de DII em M nove, e uma única população requer apenas 400 microlitros da diluição de trabalho. Inicie com uma placa de 60 milímetros contendo nematoides não contaminados. Lave os animais da placa com 1,5 mililitro de Triton X 100 a 0,5%.
No tampão M nove, gire suavemente o líquido em movimentos circulares para soltar todos os animais larvais e adultos, e então transfira a lavagem para um tubo de 1,5 mililitro. Imediatamente, centrifugue os animais a 2000 RRP M durante 30 segundos para recolher os animais no fundo do tubo. Descarte o sobrenadante possível sem perturbar os animais.
Seja cuidadoso, não ganancioso. Lave os animais com um mililitro de M nove. Centrifugue e remova o sobrenadante.
Repita a lavagem. Centrifugue novamente e remova o sobrenadante. Em seguida, adicione 400 microlitros de 30 microgramas por mililitro de Dai em M nove ao tubo.
Vortexe o tubo brevemente para ressuspender os animais. Em seguida, agite o tubo a 20 graus Celsius em posição horizontal por três a 16 horas a 350 RPM em um ambiente protegido da luz. O tempo dessas últimas etapas é importante.
Primeiro, o Triton X deve ser removido antes que elimine os lipídios aos quais o dai se liga. Segundo, os animais devem ser corados na solução de corante ocular por tempo suficiente para permitir uma coloração uniforme da cutícula. Um pouco depois, os animais devem ser deixados em repouso sobre alimento por tempo suficiente para remover o corante ocular não ligado.
No final da coloração, centrifugue os animais e remova a solução de corante. Lave os animais com um mililitro de M nove. Para remover o corante não ligado, centrifugue os animais e remova o sobrenadante.
Re-suspenda os animais em 400 microlitros de tampão M nove e despeje-os em uma porção livre de bactérias de uma microplaca NGM. Semeada com E. coli OP50, permita que os animais se recuperem no escuro por pelo menos 30 minutos, mas não por mais de um dia, pois a fluorescência do corante desvanece durante o tempo de recuperação. Os animais devem rastejar para longe do líquido de coloração e em direção ao alimento.
Esses animais são mais fáceis de imagens, pois apresentam menor fluorescência de fundo proveniente do corante livre no olho. Comece preparando uma camada de agarose em uma lâmina para garantir espessura uniforme da camada de agarose utilizada. Dois espaçadores.
Um espaçador é feito sobrepondo dois pedaços de fita adesiva laboratorial em uma lâmina de vidro. Os espaçadores podem ser usados indefinidamente. Em seguida, posicione uma lâmina de vidro limpa no sentido longitudinal entre duas lâminas espaçadoras, pipetando cerca de 150 microlitros de ágar quatro fundido.
No centro da lâmina de vidro limpa. Rapidamente, cubra a AER fundida com uma lâmina adicional colocada perpendicularmente sobre a AER e ambos os espaçadores para formar uma almofada de ágar. Deslize cuidadosamente a lâmina de cobertura, mantendo a almofada centralizada na parte superior da lâmina de montagem.
Agora, pipete cinco microlitros de anestésico para nematoides sobre a lâmina, posicione oito a 12 animais no anestésico e cubra suavemente com uma lamínula para microscopia. Observe os animais utilizando um microscópio composto ou confocal equipado com uma objetiva de pelo menos 40 x e um filtro trissy ou outro filtro compatível. O máximo de excitação fluorescente do corante dye eye é 549 nanômetros e seu máximo de emissão é 565 nanômetros.
Para espécimes fixados, a obtenção de imagens é a parte mais desafiadora deste protocolo. Mostramos como montar os animais para a aquisição de imagens, mas é necessário ter treinamento adequado no uso do microscópio composto ou confocal que será empregado. Descobrimos que o uso de uma objetiva com aumento de pelo menos 60 x é o mais indicado para resolver os detalhes iluminados pelo método de coloração.
Cada uma das imagens desta seção foi obtida utilizando uma objetiva de 63 x em embrião pós-natal de C. elegans. A superfície da cutícula contém anéis separados por sulcos circunferenciais e, em alguns estágios, cristas longitudinais denominadas ailey. Cada uma das imagens nesta seção foi capturada com uma objetiva de 63 x em C. elegans pós-embrionário.
A superfície da cutícula contém anéis anuais separados por sulcos circunferenciais e, em alguns estágios, cristas longitudinais chamadas aley. Cada estágio de desenvolvimento possui estruturas da cutícula com composições e padrões distintos, sendo que as cristas ou sulcos tanto de aley quanto de Aly são corados fluorescentemente, dependendo da composição da superfície.
Durante todos os estágios de larva e adulto utilizando este método de coloração por imersão, eles permanecem visíveis por até um dia após a recuperação. Manchas fluorescentes de fundo são ocasionalmente observadas, mas não rotineiramente. Este é o tegumento de animais mutantes adultos exibindo defeitos moderados na organização do tegumento.
As cristas de Ailey são descontínuas e supranumerárias. As cristas de Ailey estão fundidas e ramificadas ou bifurcadas, um marcador transgênico comum. Um alelo dominante de rolamento seis provoca torção da cutícula, o que pode ser observado na ailey e pode fazer com que os anéis apresentem padrões irregulares.
Dai também cora outras estruturas do cutículo externo, incluindo o adulto hermafrodita, vulva e cauda do macho adulto; elevação e leque do dai também podem destacar defeitos sutis na morfologia externa, como esta cauda bifurcada, coloração insuficiente. Por exemplo, uma coloração de duas horas resulta em coloração cuticular irregular, embora neurônios expostos ao ambiente possam ser corados. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em quatro horas, sem incluir a etapa de imagem, se for executada corretamente. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como corar C. elegans com o corante Dai para observação do cutículo e outras estruturas morfológicas externas.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um método para visualizar a cutícula em C. elegans vivos utilizando o corante lipofílico fluorescente vermelho DiI. O protocolo otimizado permite a observação de aléolos e estruturas cuticulares anulares por meio de microscopia composta.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia
- Técnicas de Imagem
Antecedentes
- Visualizar o cutícula em organismos transparentes é essencial para o estudo da morfologia.
- Os métodos existentes incluem imagem direta e coloração por anticorpos.
- DiI é comumente usado para visualizar neurônios em C. elegans.
- Este estudo tem como objetivo melhorar a visualização de estruturas cuticulares.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método simples e eficaz para coloração da cutícula em C. elegans vivos.
- Aumentar a resolução da imagem da estrutura cuticular.
- Fornecer uma alternativa econômica às técnicas existentes de visualização.
Métodos Utilizados
- Preparação de uma população de C. elegans para coloração.
- Incubação de nematoides em corante DiI diluído.
- Recuperação dos animais da solução de coloração.
- Imagem de fluorescência para observar detalhes cuticulares corados.
Resultados Principais
- A coloração com DiI destaca efetivamente as alas e as estruturas anulares.
- A imagem de fluorescência revela a morfologia detalhada da superfície.
- O método é rápido, fácil de realizar e economicamente viável.
- Os resultados demonstram alta resolução das estruturas cuticulares em animais vivos.
Conclusões
- Essa técnica oferece uma vantagem significativa em comparação com os métodos tradicionais.
- Ela permite a visualização detalhada de características cuticulares em C. elegans vivos.
- O método pode ser amplamente adotado para diversas aplicações de pesquisa.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A visualização de estruturas cuticulares em C. elegans vivos permite a redução mecanicista de riscos nas vias de desenvolvimento epidérmico e organização da cutícula. Este método auxilia na validação de alvos ao fornecer leituras fenotípicas quantitativas para perturbações genéticas e farmacológicas. A abordagem oferece confiança preditiva no estágio inicial de descoberta, associando a morfologia da cutícula a modelos de locomoção, imunidade inata e evolução de nematódeos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas relacionadas à organização do colágeno da cutícula e ao desenvolvimento celular epidérmico.
- Valor Operacional: Oferece um ensaio robusto e reprodutível para validação funcional de alvos em modelos de doenças baseados em nematoides.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao associar defeitos na cutícula a características morfológicas e vias de genes heterocrônicos.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Fornece leituras fluorescentes de alta resolução de anéis, alas, vulva e estruturas da cauda para triagem de compostos.
- Valor Operacional: Oferece um protocolo de coloração rápido, econômico e escalonável, compatível com fluxos de trabalho de imagem em animais vivos.
- Prontidão do Ensaio: Gera saídas morfológicas padronizadas e quantificáveis para validação de hits e identificação de compostos líderes.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Conecta a visualização da cutícula a modelos pré-clínicos de imunidade inata e distúrbios do desenvolvimento.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Permite a observação de defeitos na cutícula em mutantes, apoiando o alinhamento de biomarcadores para a integridade epidérmica.
- Sistema Relevante para Doenças: Aplicável a estudos sobre evolução de nematoides e desenvolvimento de características morfológicas relevantes para triagem de parasiticidas.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a testagem de hipóteses sobre alvos até a triagem fenotípica e a validação pré-clínica, permitindo o aprimoramento iterativo de compostos moduladores da cutícula.
- Biologia de Descoberta: Apoia a clarificação de vias relacionadas à organização da cutícula e à secreção epidérmica por meio da visualização direta de perturbações estruturais.
- Triagem: Oferece coloração pronta para ensaio e reprodutível, com saídas de imagem quantitativas para avaliação do efeito de compostos.
- Análises: Fornece leituras baseadas em fluorescência da integridade da cutícula, permitindo comparação estatística entre condições genéticas ou de tratamento.
- Pesquisa Translacional: Conecta a descoberta científica à continuidade pré-clínica ao visualizar estruturas da cutícula associadas a fenótipos de motilidade e imunidade.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma plataforma de imagem reutilizável para estudos longitudinais da dinâmica da cutícula em diferentes estágios de desenvolvimento e contextos genéticos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade mecanicista nas vias relacionadas à cutícula.
- Valor Operacional: Garante padronização, reprodutibilidade e escalabilidade entre laboratórios por meio de um protocolo simples e economicamente viável.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avanço ou interrupção ao permitir a detecção precoce de sinais de toxicidade ou eficácia mediados pela cutícula.
- Impacto no Portfólio: Facilita a priorização ajustada ao risco de compostos com base na gravidade e reversibilidade do fenótipo da cutícula.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em microscopia de fluorescência e manipulação de animais vivos.
- Necessita de acesso a microscópios compostos ou confocais com conjuntos de filtros apropriados (excitação em 549 nm, emissão em 565 nm).
- Exige padronização entre equipes quanto à duração da coloração, etapas de lavagem e condições de recuperação para minimizar a variabilidade.
- Envolve considerações de adaptação para diferentes linhagens e estágios de desenvolvimento de C. elegans, devido à composição variável da cutícula.
- Inclui limitações práticas, como o desbotamento do corante durante a recuperação e a possível fluorescência de fundo proveniente do corante não ligado.
