Constrição crônica do nervo ciático e Teste de Hipersensibilidade dor em ratos

O objetivo geral deste procedimento é realizar uma constrição crônica, lesão do nervo ciático, um modelo comumente utilizado em roedores para dor neuropática, e medir quantitativamente os comportamentos de dor resultantes. Isso é realizado primeiramente posicionando quatro ligaduras de tripa crômica ao redor do nervo ciático exposto ao nível da região medial da coxa, para criar uma lesão por constrição no nervo ciático. Em seguida, monitoram-se os comportamentos de dor na pata traseira nos pontos temporais desejados, medindo-se quantitativamente o limiar de retirada da pata a um estímulo mecânico usando um estilete von Frey e a latência de retirada da pata a um estímulo térmico usando um analgesímetro plantar.

Resultados finais podem ser obtidos demonstrando a existência de dor mecânica e térmica, bem como hipersensibilidade na pata traseira lesionada, por meio da medição das respostas evocadas de retirada a estímulos mecânicos e térmicos. Esse método de lesão do nervo periférico, inicialmente desenvolvido por Bene e Z, pode nos ajudar a responder questões fundamentais no campo da dor crônica, como quais são os mecanismos periféricos e centrais pelos quais a dor neuropática é gerada. As implicações dessa técnica estendem-se para a terapia da dor neuropática, pois esse modelo fornece a base para examinar novas estratégias destinadas a reduzir a hipersensibilidade à dor.

Em geral, indivíduos novos neste método terão dificuldades, pois posicionar os pontos intestinais cmic ao redor do nervo estático e com uma tensão apropriada para causar lesão nervosa suficiente, mas não excessiva, é particularmente desafiador. Para iniciar este procedimento, desinfete a superfície cirúrgica com etanol 70% e prepare os instrumentos estéreis, gaze, grampos e curativos, que foram previamente autoclavados. Em seguida, anestesie a rata em uma câmara de indução usando 5% de ISO fluoreto.

Administre 2% de ISO com flúor a ele por meio de uma máscara facial personalizada durante a cirurgia. Em seguida, depile a pata traseira esquerda da rata e coloque o animal sobre um tapete aquecido com temperatura regulada em 37 graus Celsius. Aplique pomada oftálmica lubrificante nos olhos.

Em seguida, prepare o fio de sutura de tripa cromada cortando-o em pequenos pedaços de cerca de três centímetros e mergulhe-os em soro fisiológico estéril. A seguir, esterilize a área depilada com três aplicações alternadas de álcool e solução de iodo. Com o animal deitado sobre o tórax, eleve a pata traseira esquerda e mantenha o fêmur em um ângulo de 90 graus em relação à coluna vertebral utilizando fita crepe no pé.

Em seguida, faça uma incisão na pele cerca de três a quatro milímetros abaixo do fêmur. Separe a pele do músculo ao redor da incisão cortando o tecido conjuntivo. Use uma tesoura romba para cortar o tecido conjuntivo entre os músculos glúteo superficial e bíceps femoral.

Em seguida, utilize um afastador para ampliar a distância entre os dois músculos, permitindo uma visualização clara do nervo ciático; depois, use a pinça e a tesoura microcirúrgica para liberar suavemente cerca de 10 milímetros do nervo ciático do tecido conjuntivo ao seu redor. Posicione a primeira ligadura proximal à trifurcação do nervo ciático para cada ligadura. Comece com um único laço solto.

Em seguida, segure as duas extremidades próximas ao laço e puxe até que o laço fique levemente firme e a ligadura não deslize ao longo do nervo. Então, mantenha o laço na posição correta e coloque um segundo laço sobre o primeiro laço para completar o nó. A seguir, corte as pontas soltas da ligadura deixando-as com aproximadamente um milímetro de comprimento; a constrição do nervo deve ser mínima.

Repita os passos para as três ligaduras restantes, amarrando cada ligadura adicional um milímetro mais proximal em relação à anterior. Também com mínima constrição ao final da cirurgia, utilize suturas para fechar a camada muscular e grampos para fixar a pele. Em seguida, use solução de iodo para esterilizar a ferida.

Observe atentamente o animal durante o período de recuperação da anestesia e permita que ele se recupere em uma gaiola separada com cama de papel plano. Antes de iniciar o experimento, manipule o animal diariamente por vários dias.

Em seguida, antes dos testes comportamentais, habitue a rata na caixa. O ambiente de teste deve ser mantido silencioso e bem controlado, com temperatura e umidade constantes, e cada sessão de teste deve ser realizada aproximadamente no mesmo horário do dia. Para estudar o limiar de retirada mecânica no dia do teste, coloque a rata na gaiola de teste com piso de malha elevado, de 15 a 30 minutos antes do experimento, utilizando um analgesímetro plantar dinâmico von Frey; posicione a unidade estimuladora tátil com o filamento diretamente sob a superfície plantar média da pata traseira e pressione a tecla de início.

Isso eleva o filamento para estimular mecanicamente a superfície plantar da pata traseira com uma força crescente. Em seguida, registre o limiar mecânico de retirada de ambas as patas traseiras lesionadas e não lesionadas. Este dispositivo registra e exibe automaticamente o valor máximo aplicado durante a reação de retirada.

Repita a estimulação mecânica três vezes com um intervalo de cerca de cinco minutos entre os estímulos, testando as patas traseiras não lesionadas em ordem contra-balanceada, e então calcule a média dos limiares de retirada da pata. Para estudar a latência térmica de retirada no dia do teste, coloque a rata sobre o piso de vidro. Coloque a rata na gaiola de teste de 15 a 30 minutos antes do experimento; utilizando um equipamento térmico para analgesia plantar, posicione a fonte de infravermelho diretamente sob a superfície plantar média da pata traseira e pressione a tecla de início.

Isso expõe a superfície plantar da pata traseira a um feixe de calor radiante através de uma superfície de vidro transparente. Em seguida, registre a latência de retirada tanto das patas traseiras lesionadas quanto das não lesionadas. Este dispositivo registra automaticamente o tempo decorrido desde o início do estímulo térmico até a retirada da pata da fonte de calor.

Repita a estimulação térmica pelo menos três vezes com um intervalo de cerca de cinco minutos entre os estímulos, testando as patas traseiras lesionadas e não lesionadas em ordem contrabalanceada, e então calcule a média das latências de retirada da pata. Aqui é mostrado o limiar de retirada mecânica em ambas as patas, lesionada e não lesionada, de ratos Wistar antes e até 12 dias após a constrição crônica do nervo isquiático. Há uma redução significativa no limiar de retirada da pata em resposta a estímulos mecânicos na pata traseira ipsilateral lesionada em comparação com a pata traseira contralateral não lesionada. É mostrada aqui a latência térmica de retirada em ambas as patas, lesionada e não lesionada, antes e até 12 dias após a constrição crônica do nervo isquiático.

Da mesma forma, a latência ao reflexo térmico é significativamente reduzida na pata traseira ipsilateral lesionada em comparação com a pata traseira contralateral não lesionada. Uma vez dominada a cirurgia de CCI, ela pode ser adequadamente realizada em apenas 20 minutos por animal, resultando em hipersensibilidade à dor de longa duração na pata traseira. Ao tentar realizar este procedimento, é importante lembrar de amarrar as ligaduras de forma frouxa, pois é o estrangulamento espontâneo sob as ligaduras após o edema que causa a constrição após o seu desenvolvimento.

Esta técnica de lesão do nervo periférico combinada com testes de hipersensibilidade à dor na onda P fornece aos pesquisadores na área da dor neuropática uma ferramenta para explorar os mecanismos subjacentes à dor crônica decorrente de lesão nervosa.