Formulação de nanopartículas poliméricas através da técnica de dibloco Nanoprecipitation

O objetivo geral deste procedimento é sintetizar nanopartículas poliméricas utilizando um método de nanoprecipitação. Isso é realizado primeiramente executando uma reação E-D-C-N-H-S para gerar o copolímero A-P-L-G-A PEG. O copolímero PLGA PEG é então utilizado para gerar nanopartículas, encapsulando o fármaco ou carga de interesse por meio de nanoprecipitação.

Neste ponto, a caracterização biofísica básica, incluindo tamanho, carga superficial e eficiência de carregamento do fármaco, pode ser realizada por espalhamento dinâmico da luz, microscopia eletrônica de transmissão ou HPLC. As implicações desta técnica estendem-se à terapia de tumores, pois as nanopartículas podem veicular terapêuticos antineoplásicos pouco solúveis, os quais podem ser mais eficazes do que os tratamentos atuais. Embora este método possa fornecer insights sobre o tratamento do câncer.

Ele também pode ser utilizado para estudar outros sistemas, como o tráfego celular. As nanopartículas podem ser conjugadas com um ligante de direcionamento e visualizadas in vivo ou in vitro por meio do uso de um agente de imagem, demonstrando a técnica. Hoje estarão dois técnicos do nosso laboratório, Rohit Sukumar e Natalie Cummings, para iniciar a síntese do copolímero PLGA PEG, dissolvendo PLGA, carboxilato, em acetonitrila numa concentração de cinco milimolar com agitação suave.

Em seguida, adicione quantidade suficiente de NHS e EDC para obter concentrações de 25 milimolares, fornecendo um excesso estequiométrico de cinco vezes em comparação com o PLGA; agite suavemente a solução por cerca de uma hora para permitir que o carboxilato de PLGA seja convertido em PGA-NHS. Após uma hora, precipite o produto da reação PGA-NHS adicionando a solução de lavagem, metanol, em volume aproximadamente dez vezes maior, em excesso em relação à solução; centrifugue a solução a 2000 × g para formar o pellet do PGA-NHS. Após a centrifugação, descarte o sobrenadante para remover traços de EDC e NHS. Este procedimento de lavagem com metanol é repetido pelo menos três vezes.

Após a lavagem estar completa, seque o pellet de P-L-G-A-N-H-S sob vácuo por 30 minutos para remover quaisquer vestígios da solução de lavagem. Em seguida, redissolva o pellet de P-L-G-A-N-H-S em acetônitrila na mesma concentração que foi inicialmente utilizada para dissolver o PLGA.

Uma vez dissolvido, adicione o PEG heterobifuncional à solução de PLGA. Adicione uma concentração de cinco milimolar.

Incube a solução da mistura por 24 horas com agitação constante após 24 horas. Precipite o produto da reação do copolímero em bloco PLGA PEG adicionando metanol em excesso. Realize o processo de lavagem e centrifugação adicionalmente três vezes para remover todo o PEG não reagido em excesso.

Como etapa final da síntese, seque o copolímero em bloco PLGA PEG sob vácuo. A precipitação de nanopartículas começa com a dissolução do copolímero em bloco PLGA PEG e do fármaco a ser encapsulado no solvente A-P-L-G-A. A escolha do solvente é crítica, pois influencia as propriedades da nanopartícula. Em seguida, adicione a mistura de polímero e fármaco, gota a gota, a três a dez volumes de água sob agitação, para obter uma concentração final de polímero de cerca de três miligramas por mililitro. Gota a gota.

A adição da solução orgânica à fase aquosa é essencial para a formação de nanopartículas do tamanho correto. Continue a agitação por duas horas sob pressão reduzida para permitir que as nanopartículas se formem por autoagregação e remova traços do solvente orgânico. Após duas horas de agitação.

Concentre as nanopartículas por centrifugação a 2.700 × g durante 10 minutos usando um filtro Amon. Em seguida, lave as nanopartículas com PBS para remover qualquer fármaco não encapsulado e proceda com nova centrifugação. Por fim, reconstitua as nanopartículas em PBS neste ponto.

A caracterização biofísica básica, incluindo tamanho, carga superficial e eficiência de carregamento de fármaco, pode ser realizada para compreender melhor as propriedades das nanopartículas. As nanopartículas podem ser armazenadas conforme descrito no protocolo escrito; para caracterizar as nanopartículas de PLGA PEG, foi utilizada microscopia eletrônica de transmissão para confirmar o tamanho, distribuição e estrutura das nanopartículas. O tamanho das partículas geralmente está na faixa de nanômetros.

Tamanhos grandes de partículas com distribuições de tamanho irregulares podem indicar um erro na reação de conjugação ou que o método de nanoprecipitação precisa ser otimizado. Aqui é apresentado um estudo cinético de liberação de fármaco no qual a eficiência de incorporação e a liberação de paclitaxel foram quantificadas por HPLC padrão. Quantidades fixas conhecidas das nanopartículas foram submetidas à diálise em intervalos de tempo fixos.

O conteúdo da unidade de diálise foi coletado e um volume igual de solvente orgânico foi adicionado para dissolver as nanopartículas. Em seguida, foi realizada a CLAE nessas amostras. Para quantificar o teor de paclitaxel, uma vez dominada, essa técnica de nanoprecipitação pode ser adequadamente realizada em três horas.

Lembre-se de que, ao realizar esta técnica, é sempre necessário adicionar lentamente a fase orgânica à fase aquosa para evitar a formação de partículas grandes após seu desenvolvimento. Esta técnica abriu caminho para pesquisadores de câncer na área da nanomedicina explorarem o uso de fármacos pouco solúveis que antes eram considerados tóxicos demais para pacientes com câncer após este procedimento. Outros métodos, como estudos de eficácia in vivo ou estudos de imagem, podem ser realizados para responder perguntas como se fármacos pouco solúveis são eficazes, quando a toxicidade sistêmica já não é um problema, ou se ligantes de direcionamento direcionam adequadamente as nanopartículas ao seu destino.