Detecção de hipóxia microrregional no Cortex Cerebral mouse por imagem de dois fótons de fluorescência endógena NADH

O objetivo geral deste procedimento é visualizar diretamente a hipóxia tecidual microregional no córtex de camundongos in vivo. Isso é realizado primeiramente preparando uma janela craniana com crânio aberto em um camundongo anestesiado. Em seguida, um corante fluorescente é injetado por via intravenosa para marcar os vasos sanguíneos cerebrais.

Por fim, realiza-se simultaneamente a imagem de fótons da fluorescência intrínseca do NADH e da microvasculatura cortical marcada com fluoróforo. Em última análise, podem-se obter resultados que demonstram hipóxia funcional em micro-regiões do parênquima cerebral mediante a visualização da presença da forma reduzida da nicotinamida adenina dinucleotídeo. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como os eletrodos do tipo Clark, é que ela fornece uma alta resolução espacial em um amplo campo de visão e também é menos invasiva.

Este método pode ser realizado em um sistema fotográfico padrão aplicado com dois canais fluorescentes. Olá, sou Steve Hurst, professor e chefe do departamento de microbiologia e imunologia da Universidade de Rochester, e demonstrando o procedimento hoje estará o filho de Anita do Laboratório Kishka, bem como Oxana Paulka, professora assistente de pesquisa do meu laboratório. O Dr. Kishka, que foi pioneiro na técnica de imagem de NADH, não pode estar aqui hoje porque se mudou recentemente para a Alemanha. Após preparar o local cirúrgico com os instrumentos necessários, que foram autoclavados ou desinfetados com etanol a 70%, e anestesiar o camundongo com isoflurano a 5%, coloque-o sobre uma almofada aquecida e aplique uma máscara facial para fornecer isoflurano entre 1,3 e 1,5% no ar.

Verifique o nível de anestesia realizando uma pinça na cauda. Em seguida, insira uma sonda retal e meça continuamente a temperatura corporal do animal durante todo o procedimento. Aplique gel lacrimal artificial nos olhos do camundongo para evitar que sequem.

Em seguida, remova os pelos da cabeça e de ambas as coxas; aplique removedor de pelos na coxa durante dois minutos para remover os pelos remanescentes, pois a coxa será usada para oximetria. Por fim, desinfete o couro cabeludo utilizando uma solução de poviodona-iodo a 10% e etanol a 70%. Para fazer uma janela craniana, comece cinco milímetros afastado do crânio com uma tesoura.

Feche um corte no couro cabeludo e avance um centímetro. Afaste a pele para os lados para expor o crânio. Remova as membranas localizadas na parte superior do crânio. Aplique uma solução de cloreto férrico a 10%.

Remova a solução em excesso e raspe as membranas com um ângulo de 45 graus. Passo cinco, pinça: usando um microscópio de dissecação, identifique a área de interesse. Aplique uma camada fina de cola rápida ao redor das bordas da janela da placa craniana.

Posicione a placa craniana de modo que a área de interesse fique exposta na janela e aplique uma leve pressão sobre a placa craniana. Aplique uma pequena quantidade de cimento dental para polimerizar rapidamente a cola. Mantenha por 10 segundos enquanto a cola estiver polimerizando.

Aplicar uma pequena quantidade de cola rápida nas bordas da janela para selar a placa craniana e o crânio. Em seguida, parafusar a placa craniana ao suporte do animal sob o microscópio de dissecação. Utilizar o microtorno com conjunto de brocas ajustado a 6.000 RPM e a broca IRF 0 0 5.

Remova toda a cola extra do crânio e da placa craniana. Em seguida, ajuste o torno para mil RPM e comece a furar o crânio fazendo um círculo dentro da janela da placa craniana com um diâmetro de cerca de cinco milímetros. Use movimentos leves e amplos, como se estivesse desenhando com um lápis muito macio.

Interrompa a perfuração a cada 20 a 30 segundos e use ar comprimido para remover a poeira óssea. Conforme a perfuração avança, um sulco é formado ao redor do crânio intacto no centro. Tenha cuidado para não perfurar o crânio fino, mas certifique-se de que esse sulco tenha espessura uniforme.

Além disso, tenha cuidado redobrado em torno de vasos sanguíneos grandes. Eles não devem ser comprometidos e, se possível, nem mesmo tocados. Com uma das pontas de uma pinça, levante o osso no centro da janela e aplique uma gota de fluido cerebroespinhal artificial sobre a janela. Usando o canto de um lenço de papel Kim, limpe suavemente o fluido cerebroespinhal artificial com um ângulo de 45 graus.

Número cinco, pinça. Localize uma região de dura-máter danificada ao longo da borda da janela e levante-a para removê-la. Se houver sangramento, aplique uma gota de LCR artificial e aguarde dois a três minutos para que o sangramento leve cesse.

Em seguida, prepare 10 mililitros de aero de baixo ponto de fusão a 0,07% dissolvido em fluido cerebroespinhal artificial. Aqueça o aero fundido até a temperatura corporal. Remova o excesso de fluido cerebroespinhal artificial da superfície do cérebro.

Despeje o aerogel na janela e cubra-o com uma lâmina de vidro. Em seguida, pressione suavemente a lâmina para garantir o contato entre o vidro e a placa de base e aguarde de 10 a 20 segundos até que o aerogel solidifique. Com o auxílio de pinças e papel toalha macio, remova o excesso de aerogel da lamínula de vidro.

Coloque uma pequena quantidade de cola rápida ao redor do vidro para colá-lo à placa craniana. Em seguida, aplique uma pequena quantidade de cimento dental para solidificar a cola antes da injeção na veia femoral. Vire parcialmente o animal para expor a parte interna da coxa esquerda.

Use fita adesiva para imobilizar o animal. Nessa posição, aplique uma solução antisséptica e, em seguida, etanol a cem por cento na pele. Em seguida, faça uma incisão ao longo da coxa medial, do joelho até a sínfise púbica.

Se necessário, separe os tecidos moles por dissecação romba. Encha uma seringa de um mililitro com 130 microlitros de Texas red. Acople uma nova agulha de 30 graus e dobre-a cuidadosamente em um ângulo de 30 graus, mantendo o bisel para cima.

Encha a agulha com a Solução Texas Red sob um microscópio estereoscópico, insira a agulha na veia femoral e injete cem microlitros de Texas Red. Remova a agulha e pressione levemente a veia com gaze para estancar o sangramento. Feche a pele usando sutura 4-0 para monitoramento contínuo da saturação de oxigênio no sangue.

Coloque a sonda do oxímetro na coxa direita, da qual o pêlo foi previamente removido. Para iniciar a imagem, transfira o camundongo cirurgicamente preparado para a platina do microscópio. Tire uma imagem inicial do local da janela craniana utilizando iluminação em Campo Claro com ampliação de quatro vezes para usar como mapa de referência para o registro com maior ampliação e captura de fótons.

Aproxime a área de interesse usando ampliação de 10 x. Selecione uma área de interesse nas camadas corticais. Um ou dois começam a registrar a série temporal.

Recomenda-se utilizar uma média de três a cinco quadros para aumentar a qualidade da imagem. Em seguida, induza hipoxemia adicionando 50% de nitrogênio ao ar que o animal está respirando. Isso reduzirá o nível de oxigênio para 10%. Verifique a hipoxemia monitorando os dados do oxímetro.

Continue registrando a série temporal durante a hipoxemia por cerca de 30 segundos e após a restauração do nível normal de oxigênio. Colete dados para o cálculo da distribuição de oxigênio detectando, medindo e quantificando a área de hipóxia e os cilindros de tecido oxigenado ao redor dos vasos sanguíneos. Para determinar o raio R do cilindro de tecido croak, meça a distância entre o centro do vaso sanguíneo e o limite no qual é detectada alta fluorescência de NADH.

Consulte o protocolo escrito para os métodos de processamento de dados. Esta figura mostra imagens simultâneas de NADH e geografia obtidas por vídeo durante hipoxemia transitória, na qual a concentração de oxigênio inspirado foi reduzida de 21% para 10% por um período de três minutos. Esse nível de hipoxemia induzida experimentalmente é suficiente para provocar hipóxia grave na córtex cerebral.

A hipóxia levou a um aumento na fluorescência de NADH, mostrada inicialmente em verde nas áreas mais distantes do suprimento sanguíneo arterial. Observe os limites nítidos do tecido com NADH, que representam os limites visíveis da difusão de oxigênio a partir da microcirculação cortical, mostrada em vermelho. Aqui está uma imagem simultânea dos microvasos rotulados fluorescentemente no córtex em vermelho e da fluorescência intrínseca de NADH da substância cinzenta do córtex em verde; a distribuição da intensidade da fluorescência de NADH é binária.

Existem áreas com fluorescência de NADH uniformemente baixa e áreas com fluorescência de NADH uniformemente alta. As linhas amarelas representam os limites teciduais entre as áreas com fluorescência baixa e alta de NADH. Esses limites teciduais exibem uma relação espacial com os microvasos próximos.

Essa relação é determinada pela difusão de oxigênio dos microvasos para o tecido. Em alguns casos, a natureza cilíndrica ou o cilindro tecidual CRO desses limites teciduais pode ser diretamente reconhecida, conforme indicado pelas linhas azuis. Aqui, o limite tecidual possui formato circular com um vaso sanguíneo central concêntrico, uma vez dominado.

Essa técnica pode ser realizada em 1,5 hora se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de colar o lamínula à placa metálica para evitar o movimento vertical da superfície cortical devido ao edema. Após este procedimento, análises adicionais podem ser realizadas, como medições de hiperemia funcional com o objetivo de responder a questões adicionais, tais como a relação entre hipóxia tecidual e acoplamento cerebrovascular.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como visualizar a hipóxia tecidual microregional no córtex de camundongos.