Quantificação de Vascular Cerebral Arquitetura usando dois fótons Microscopia em um modelo de mouse Neuroinflammation induzida por HIV

O objetivo geral deste procedimento é quantificar as alterações nas redes capilares corticais após exposição prolongada à virotoxina do HIV, tat. Este método pode ajudar a examinar as principais alterações na morfologia capilar cortical que podem contribuir para a patogênese dos distúrbios neurocognitivos associados ao HIV. A principal vantagem desta técnica é que ela permite a quantificação fisiologicamente precisa de múltiplos parâmetros morfológicos capilares.

Embora este método possa fornecer informações sobre a patogênese dos distúrbios neurocognitivos associados ao HIV. Também pode ser aplicado a outras doenças nas quais ocorrem alterações vasculares, como a doença de Alzheimer. Comece este procedimento aplicando gel lacrimal artificial nos olhos de um camundongo anestesiado.

Em seguida, raspe a cabeça usando um barbeador elétrico. Em seguida, aplique a solução de iodopovidona para esterilizar o couro cabeludo e deixe secar. Sob um microscópio de luz, remova o couro cabeludo do animal, para expor completamente os ossos parietais, os ossos frontais caudais e o ponto de bregma.

Aplique uma pequena quantidade de uma solução de cloreto férrico a dez por cento no crânio, a fim de secar a membrana para facilitar a remoção. Em seguida, remova a membrana seca, raspando suavemente o crânio com a pinça. Em seguida, aplique uma fina camada de cola ao redor da janela da placa da cabeça.

Pressione suavemente a placa da cabeça contra o crânio do mouse, para manter a área de interesse no centro da janela. Em seguida, aplique uma gota de cimento dentário na placa principal, para polimerizar a cola. Em seguida, aplique uma fina camada de cola ao longo da borda da janela da placa principal para criar um reservatório para reter a solução salina.

Depois que a cola secar, aparafuse a placa da cabeça no chicote da placa da cabeça do mouse. Remova qualquer cola da janela da placa da cabeça usando uma broca presa a uma broca de micro-torp, ajustada para 6.000 rpm. Pare a cada 10 a 15 segundos para evitar o superaquecimento do crânio do camundongo.

Depois disso, usando uma nova broca, comece a afinar o crânio usando uma broca de micro-torp ajustada a 4.000 rpm. Mova a broca suavemente pelo crânio sem pressão direta para baixo. Quando o crânio estiver completamente afinado, retire o mouse do suporte e coloque-o de costas.

Grave suavemente os dois membros posteriores para expor claramente as coxas mediais. Em seguida, remova o cabelo sobre as duas coxas mediais e desinfete o local da cirurgia cobrindo as coxas com iodopovidona. Em seguida, remova suavemente a pele da coxa medial direita, acima da veia e artéria femoral.

Aplique aproximadamente três a cinco gotas de solução salina a 0,9% no local da cirurgia. Em seguida, separe a veia femoral da artéria, dissecando sem corte o feixe neurovascular femoral. Agora, coloque dois pedaços de sutura cirúrgica de três centímetros, embaixo da artéria femoral, a aproximadamente um centímetro de distância.

Gire a sutura superior no sentido horário para criar um torniquete vascular que ajudará a evitar a perda excessiva de sangue durante o cateterismo. Posteriormente, faça uma pequena incisão na artéria femoral com tesoura de mola, onde posteriormente será inserido o cateter para monitorar os parâmetros fisiológicos do camundongo. Neste procedimento, remova a pele da coxa esquerda medial do camundongo.

Em seguida, localize a veia femoral. Usando uma seringa de um mililitro e uma agulha de calibre 30, retire 130 microlitros da solução de corante fluorescente. Injete 100 microlitros do corante lentamente na veia femoral.

Depois de remover a agulha, aplique uma leve pressão constante no local da injeção para interromper qualquer sangramento e deixe o corante circular por cinco minutos. Em seguida, feche o local da cirurgia com suturas. Vire cuidadosamente o mouse de bruços e coloque-o no arnês da placa da cabeça do mouse.

Para imagens in vivo de dois fótons, mova o aparelho cirúrgico para o microscópio de dois fótons e certifique-se de manter o nível de anestesia do animal. Em seguida, coloque uma pequena quantidade de solução salina a 0,9% no reservatório da placa da cabeça e abaixe a objetiva do microscópio para que entre em contato com a solução salina. Em seguida, localize a área de interesse usando o objetivo de visualização de campo claro.

Depois, comece a imagem de dois fótons. Localize um leito capilar na tela de visualização e amplie essa área usando o zoom óptico também. Adquira imagens dos capilares usando o software de imagem de dois fótons.

Para imagens ex vivo de dois fótons, faça uma incisão no couro cabeludo dos ossos interparietais até os ossos frontais do camundongo decapitado. Prenda a pele nas laterais do crânio com o dedo indicador e o polegar, coloque a tesoura extra fina sob o osso interparietal medial e corte o crânio ao longo da sutura sagital até aproximadamente três milímetros após o ponto de bregma. Em seguida, separe o crânio do cérebro e remova cuidadosamente todas as meninges da superfície do cérebro com a pinça.

Deslize suavemente a pinça sob o cérebro para libertá-lo do crânio. Depois, coloque o cérebro em uma matriz cerebral, específica para camundongos, e lave-o com gotas de ACSF. Em seguida, remova uma seção cerebral coronal de milímetro de espessura.

Coloque a seção do cérebro em uma lâmina de vidro côncava contendo ACSF, com a parte mais anterior da seção voltada para cima. Em seguida, cubra suavemente a fatia do cérebro com uma lamínula de vidro. Transfira a lâmina para o microscópio stage e coloque uma pequena quantidade de solução salina a 0,9% na lamínula.

Abaixe a objetiva do microscópio até que ela entre em contato com a solução salina. Posteriormente, localize a linha média do cérebro usando a objetiva de campo claro. Agora, comece a imagem de dois fótons e localize a linha média novamente usando a objetiva de 25x.

Faça isso procurando a fissura longitudinal na superfície cortical da seção coronal. Em seguida, coloque a borda direita da tela de imagem na linha média e mova a tela do visualizador lateralmente sobre três quadros completos. Localize a profundidade em que os capilares são pouco visíveis na tela de visualização.

Em seguida, abaixe o plano de foco por mais 20 micrômetros para determinar o topo da pilha z. Defina a espessura da imagem para um micrômetro. Abaixe a tela de visualização para 100 micrômetros e ajuste a potência do laser de forma que menos de um por cento dos pixels fiquem saturados demais.

Por fim, adquira a pilha z. Nesta figura, após a preparação da fatia do cérebro, é localizada uma área de imagem a aproximadamente 1,5 milímetros da linha média. Uma pilha z de 100 micrômetros produz uma imagem tridimensional usada para análise no software Amira Analytics.

A rede capilar é então rastreada manualmente, colocando nós no início e no final de um capilar ou em qualquer local onde um capilar se ramifica em outro. Isso produz uma imagem totalmente esqueletizada da qual os parâmetros morfológicos são extraídos automaticamente. O número de nós capilares, segmentos, comprimento médio do segmento e o comprimento total do segmento podem ser extraídos usando imagens ex vivo de dois fótons de fatias de cérebro de camundongo.

Aqui, uma imagem bidimensional das redes capilares é produzida por imagens in vivo, nas quais o diâmetro capilar pode ser extraído e o volume capilar total pode ser calculado usando o diâmetro capilar e o comprimento total do segmento obtido a partir da imagem ex vivo. Uma vez dominado, este procedimento pode ser concluído em três horas e meia se for executado corretamente. Ao realizar este procedimento, é importante mover-se rapidamente, mantendo um nível constante de anestesia, pois o isoflurano pode causar vasodilatação dos capilares corticais, distorcendo assim os dados.

Durante este procedimento, outros parâmetros capilares podem ser obtidos, como velocidade dos glóbulos vermelhos ou fluxo de glóbulos vermelhos, o que pode fornecer uma compreensão mais profunda das alterações patogênicas observadas em distúrbios neurocognitivos associados ao HIV e outras doenças neurodegenerativas. Boa sorte com seus experimentos.