Visualização dos Vascular Ca 2 + Sinalização Disparado por parácrina ROS Derivado
21 de dezembro de 2011
Um método eficiente para obter insights sobre visualizando o parácrinos derivados de indução de ROS endotelial sinalização de Ca2 + é descrito. Esse método leva vantagem de medir parácrina ROS derivados provocou mobilização de Ca2 + em células endoteliais vasculares em um modelo de co-cultura.
O objetivo geral deste procedimento é visualizar a sinalização vascular de cálcio desencadeada por espécies reativas de oxigênio derivadas de pericrinas ou EROs. Isso é realizado primeiramente visualizando as EROs com corantes sensíveis à oxidação em macrófagos ativos. As EROs também podem ser visualizadas em células endoteliais utilizando sensores fluorescentes baseados em plasmídeo.
Em seguida, prossiga para visualizar simultaneamente macrófagos ativados marcados com rastreador celular vermelho e células endoteliais marcadas com fluorescência em um modelo de co-cultura. Por fim, meça a sinalização de cálcio nas células endoteliais desencadeada por espécies reativas de oxigênio derivadas de macrófagos, utilizando um sistema de imagem por microscopia confocal.
Esses resultados podem demonstrar os níveis de ERO independentemente, bem como avaliar simultaneamente a mobilização intracelular de cálcio desencadeada por ERO derivadas de Peregrine. Este método permite a avaliação simultânea de duas moléculas sinalizadoras diferentes que intimamente induzem um ambiente de sinalização vascular e condição patofisiológica simulada. Dois pós-doutorandos no meu laboratório, Karthik e Raj, demonstrarão o procedimento sobre medições de ERO e cálcio e interações entre macrófagos e células endoteliais.
Cultive macrófagos derivados de monócitos de camundongo em placas de fundo de vidro de 35 milímetros. Em seguida, desafie as células com agonistas do receptor tipo toll e incube por seis horas a 37 graus Celsius. Para visualização do citosol.
Adicione o corante sensível à oxidação e incube as células por 20 minutos. Em seguida, visualize as células em uma platina controlada por temperatura de um sistema de imagem confocal. Alternativamente, para visualizar as ERO mitocondriais em células ativadas por TLR, adicione o indicador de superóxido mitocondrial e incube as células por 30 minutos a 37 graus Celsius.
Como controle negativo, trate as células com PBS ou DMSO para um controle positivo. Trate as células com antimicina a dois milimolares. A seguir, prossiga para visualizar todas as células na platina controlada por temperatura de um sistema de imagem confocal.
Utilizando o software ImageJ, analise todos os dados de imagem. O sensor fluorescente detecta de forma hiperespecífica concentrações submicromolares de peróxido e, com base no desenho do vetor de expressão em mamíferos, pode ser direcionado para o citoplasma ou para as mitocôndrias. Utilizando eletroporação, crie linhagens estáveis de células endoteliais microvasculares pulmonares de camundongo portadoras do plasmídeo de expressão apropriada de Hyper.
Para facilitar o crescimento de colônias, plaque as células em baixa densidade em TMEM completo e incube por 48 horas; substitua o meio por meio de cultura completo suplementado com um antibiótico de seleção. Selecionar as linhagens com a maior porcentagem de células hiperpositivas e amplificar o cultivo para criar linhagens estáveis hiperpositivas em experimentos individuais. Semear as células em lamínulas revestidas com gelatina a 0,2% e cultivar durante a noite até atingir 80% de confluência.
Agora, ative as células com ligantes de TLR e incube por seis horas a 37 graus Celsius. Para a detecção de ROS citoplasmática, monte as lamínulas com células em uma câmara de células adelo. Adicione um mililitro de solução salina balanceada pré-aquecida e coloque a câmara em uma platina controlada termicamente do sistema de imagem confocal.
Registre as alterações de fluorescência nas células para a detecção de ROS mitocondrial. Inclua um controle positivo de dois micromolares de antimicina A. Em seguida, prepare as lamínulas com células tratadas para microscopia confocal. Realize a análise de imagens utilizando o software ImageJ.
Inicie com células endoteliais cultivadas até 80% de confluência sobre lamínulas de vidro revestidas com gelatina para a visualização e medição de alterações intracelulares de cálcio. Incube as células com o corante fluorescente fluo-4 AM, à temperatura ambiente, por 30 minutos para minimizar a perda do corante; lave então as células com a solução de imagem experimental contendo sulfinpirazona. Em seguida, monte as lamínulas em uma câmara de célula Adepo com 800 microlitros de solução de imagem experimental pré-aquecida e posicione as células sobre uma platina controlada termicamente do sistema de imagem confocal em um tubo separado.
Utilize 500 nanogramas por mililitro de rastreador celular vermelho C-M-T-P-X durante 15 minutos para marcar a população de macrófagos sob investigação, lave as células e reconstitua os pellets em 200 microlitros de solução experimental de imagem. Em seguida, adicione os macrófagos marcados sobre as células endoteliais carregadas com fluoh 4:00 AM na câmara de montagem para microscopia confocal e registre a fluorescência verde e vermelha a cada três segundos durante 10 minutos.
Neste experimento, as células J 7 74 0,1 foram expostas aos ligantes de TLR dois, três e quatro por seis horas. Imagens confocais representativas mostram um aumento na ROS citosólica, medido por DCF. Curiosamente, a fluorescência vermelha do mitotracker indica um aumento semelhante na ROS mitocondrial.
Essas alterações de fluorescência são quantitativas. Assim, os resultados devem ser normalizados e expressos como mudança relativa de dobramento por tratamento, sendo o sinal de antimicina A um controle positivo para a produção de ERO mitocondrial. Esta figura mostra imagens dos níveis de peróxido endotelial, citosólico e mitocondrial em células que expressam estavelmente hyper citosólico ou hyper mitocondrial D.
MP ECS estimuladas com agonistas de TLR. A quantificação da variação média da fluorescência demonstra aumento da fluorescência hiper citoplasmática e hiper D mito após seis horas de estimulação em um sistema de co-cultura. Para avaliar a sinalização de ROS Peregrine, macrófagos mirin recém-isolados de camundongos selvagens e de camundongos nulos para GP 91 Fox foram ativados com um micrograma por mililitro de LPS durante seis horas.
Os macrófagos foram marcados em vermelho com C-M-T-P-X e adicionados sobre MPM ECS carregados com flu verde quatro. Curiosamente, macrófagos ativados com LPS isolados de camundongos selvagens induziram uma grande e rápida mobilização de cálcio nas MPM ECS em comparação com macrófagos de camundongos nulos para GP 91 Fox.
Embora a tentativa LI utilize este procedimento, é importante lembrar que tanto a incubação prolongada quanto a exposição ao laser levam à auto-oxidação do DCF. É crucial evitar o branqueamento fotônico da hiper cito e da hiper D mitral. Uma vez dominada, a medida de RA em macrófagos, bem como em células endoteliais, pode ser realizada em sete horas, se for executada corretamente.
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Visão Geral
Este artigo descreve um método para visualizar a sinalização de cálcio vascular induzida por espécies reativas de oxigênio (ROS) derivadas de paracrina. A abordagem utiliza corantes sensíveis à oxidação e sensores fluorescentes para observar as ROS em macrófagos e células endoteliais dentro de um modelo de co-cultura.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Biologia Vascular
Antecedentes
- Espécies reativas de oxigênio (ROS) desempenham um papel fundamental na sinalização celular.
- Células endoteliais respondem a sinais parácrinos provenientes de macrófagos.
- A sinalização por cálcio é essencial para diversas funções celulares.
- Visualizar essas interações pode aprimorar nossa compreensão da biologia vascular.
Objetivo do Estudo
- Visualizar a sinalização de cálcio em células endoteliais desencadeada por ERO derivadas de macrófagos.
- Utilizar um modelo de co-cultura para estudar interações entre células.
- Empregar técnicas avançadas de imagem para observação em tempo real.
Métodos Utilizados
- Corantes sensíveis à oxidação para visualizar ERO em macrófagos.
- Sensores fluorescentes baseados em plasmídeo para detectar ERO em células endoteliais.
- Modelo de co-cultivo de macrófagos ativados e células endoteliais.
- Sistema de imagem confocal para medir sinalização de cálcio.
Resultados Principais
- Visualização bem-sucedida de ESP em macrófagos e células endoteliais.
- Demonstrou a mobilização de cálcio em células endoteliais após exposição a ESP.
- Destacou a importância da sinalização parácrina nas respostas vasculares.
- Forneceu uma estrutura para estudos futuros sobre interações de sinalização celular.
Conclusões
- O método visualiza efetivamente o papel das ERO na sinalização de cálcio endotelial.
- Os conhecimentos obtidos podem orientar estratégias terapêuticas direcionadas à disfunção vascular.
- É necessário realizar mais pesquisas para explorar as implicações desses achados.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método permite a visualização da sinalização parácrina de cálcio induzida por ERO em células endoteliais vasculares, fornecendo uma ligação mecanicista entre a ativação de células inflamatórias e a disfunção vascular. Ele apoia a validação de alvos ao demonstrar como as ERO derivadas de macrófagos desencadeiam vias de sinalização intracelular relevantes para lesão por isquemia/reperfusão e sepse. A abordagem oferece valor preditivo para reduzir riscos de candidatos terapêuticos direcionados à modulação da ativação endotelial mediada por ERO em modelos pré-clínicos de doenças.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Analisa a hipótese de que a ROS parácrina proveniente de macrófagos ativados induz sinalização de cálcio em células endoteliais adjacentes.
- Valor Operacional: Permite a validação funcional de fontes de ROS (por exemplo, NADPH oxidase) em vias inflamatórias utilizando sistemas de co-cultivo.
- Valor Científico: Apoia a desmistificação mecanicista ao associar a produção de ROS à sinalização dependente de cálcio downstream em células vasculares.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas padronizados de co-cultivo de endotélio e macrófagos para avaliação quantitativa do fluxo de cálcio desencadeado por espécies reativas de oxigênio.
- Valor Operacional: Utiliza corantes sensíveis à oxidação e sensores geneticamente codificados para gerar leituras de fluorescência reprodutíveis e normalizadas.
- Valor Científico: Permite a detecção simultânea de espécies reativas de oxigênio e mobilização de cálcio, apoiando o design de ensaios multiplexados para investigação de vias.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Modela a inflamação vascular relevante para doenças ao utilizar macrófagos ativados por TLR para estimular respostas de cálcio endoteliais.
- Valor Operacional: Oferece uma plataforma escalonável para comparar macrófagos selvagens e geneticamente modificados (por exemplo, gp91phox-nulos) na sinalização dependente de ROS.
- Valor Científico: Apoia o alinhamento translacional de biomarcadores ao quantificar a mobilização de cálcio como um indicador funcional da atividade parácrina de ROS.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a verificação da hipótese do alvo até a validação pré-clínica, permitindo a avaliação iterativa da sinalização vascular mediada por ERO em contextos inflamatórios.
- Biologia da Descoberta: Testa a ligação mecanicista entre a ativação de macrófagos e a sinalização de cálcio endotelial por meio de ERO.
- Triagem: Fornece sistemas de cocultivo prontos para ensaio com leituras quantitativas e simultâneas de fluxo de ERO e cálcio.
- Análises: Gera dados de fluorescência normalizados em termos de variação de expressão, permitindo comparação entre condições genéticas ou farmacológicas.
- Pesquisa Translacional: Conecta a sinalização parácrina por ERO a modelos de disfunção endotelial relevantes para sepse e isquemia/reperfusão.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma baseada em imagem reutilizável para o estudo da comunicação intercelular na inflamação vascular.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao visualizar a sinalização causal de espécies reativas de oxigênio para o cálcio em células vasculares.
- Valor Operacional: Padroniza os protocolos de preparo de cultivo em co-cultura e de imageamento para medições reprodutíveis de espécies reativas de oxigênio e cálcio entre laboratórios.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avançar ou não ao reduzir a ambiguidade mecanicista nas vias vasculares induzidas por espécies reativas de oxigênio.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de compostos que visam a NADPH oxidase ou mecanismos de eliminação de espécies reativas de oxigênio.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em cultura de células primárias, carregamento de corantes fluorescentes e microscopia confocal.
- Depende do acesso a corantes sensíveis à oxidação (por exemplo, DCF), indicadores fluorescentes de cálcio (por exemplo, Fluo-4) e sensores de ERO baseados em plasmídeos.
- Necessita padronização da ativação de macrófagos (por exemplo, dose e duração do ligante de TLR) e da confluência de células endoteliais para sinalização consistente.
- Envolve considerações de adaptação ao estender o método a células primárias humanas ou a outros tipos celulares vasculares.
- Inclui limitações práticas, como fotodegradação dos corantes e riscos de auto-oxidação durante imagens prolongadas.
