Aplicação de Medidas para MassSQUIRM quantitativa da actividade demetilase Lisina

O protocolo mass squirm tem como objetivo quantificar a atividade de lisina desmetilase utilizando metilação isotópica e espectrometria de massas MALDI. Primeiro, realize reações de desmetilação catalisadas por enzimas em peptídeos contendo lisina metilada. Em seguida, metile quimicamente os produtos peptídicos da reação de desmetilase com formaldeído deuteriorado para produzir peptídeos uniformemente metilados, que ionizam da mesma maneira por MALDI. Prossiga para quantificar cada espécie peptídica por espectrometria de massas e considere a sobreposição isotópica. A fim de identificar as quantidades relativas de peptídeos metilados com zero, mono, di e trimetilação, os resultados do mass squirm determinam as quantidades relativas de cada produto da reação de desmetilase com base nas alterações de massa.

A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a espectrometria de massa rotineira de bolor, é que a pontuação de massa leva em conta as diferenças de ionização entre peptídeos com diferentes níveis de metilação. Tivemos pela primeira vez a ideia para esta abordagem ao desenvolvermos um método para medir níveis de acetilação de histonas utilizando anidrido acético isotopicamente pesado. O desafio desta técnica é a extração dos dados de área dos picos, o que pode ser complicada pela sobreposição dos envelopes isotópicos dos peptídeos.

Para a reação de desmetilase, combine 125 nanogramas da enzima recombinante lisina específica desmetilase um com 0,25 microgramas do peptídeo de histona H3 dimetilado biotinilado em um volume final de 20 microlitros de tampão desmetilase. Prepare também uma amostra controle contendo 0,25 microgramas do peptídeo sem a enzima LSD1 e incube os tubos de reação e controle por duas horas a 37 graus Celsius. Em seguida, para preparar as esferas porosas R2 de 20 mícrons, misture volumes iguais de esferas e metanol.

Em seguida, adicione 10 volumes de ácido trifluoroacético (TFA), adicione oito microlitros de microesferas porosas a cada amostra e agite por 15 minutos à temperatura ambiente. Enquanto isso, prepare duas pontas zip C18. Pipete duas vezes com 20 microlitros de TFA 0,1%, quatro vezes com acetonitrila 70% contendo TFA 0,1% e novamente quatro vezes com TFA 0,1%.

Em seguida, carregue as duas amostras nas pontas zip previamente condicionadas. Com uma pipeta, empurre o volume através da resina C 18. Repita até que todo o volume de ambas as amostras tenha passado pelas pontas zip.

Em seguida, lave as pontas tipo zip duas vezes com 20 microlitros de TFA 0,1%, elua as amostras em 40 microlitros de tampão ilusão e seque completamente com um concentrador de vácuo. Primeiro, ressuspenda a amostra em 100 microlitros de tampão fosfato 50 milimolar, pH 7,4. Em seguida, adicione oito microlitros de borodimetilamina e 16 microlitros de formaldeído reduzido.

Incubar a quatro graus Celsius por duas horas. Repetir a metilação redutiva adicionando dimetilamina comum e formaldeído deutério e incubar por duas horas. Pela terceira vez, adicionar dimetilamina comum e incubar a quatro graus Celsius por 15 horas.

Quenche a reação com 12,5 microlitros de tris um molar, pH 7,4, e prossiga até a secagem completa com um concentrador de vácuo. Primeiro, ressuspenda as amostras dos controles e das reações com desmetilase em 100 microlitros de tampão fosfato 50 milimolar, pH 7,4.

Agora, adicione oito microlitros de esferas porosas às amostras de controle e de reação da desmetilase e colete nas pontas zip conforme mostrado anteriormente. Elua em volumes de dois microlitros sobre uma placa de amostra MALDI e deixe secar à temperatura ambiente até a cristalização. Prossiga para analisar as amostras por espectrometria de massas.

Abra os arquivos de espectro no software de trabalho e exporte para o software M sobre Z. Em seguida, verifique os produtos da reação por espectrometria de massas em tandem. Primeiro, determine a razão entre as áreas dos picos dos isótopos carbono 13 C dois e carbono 13 C quatro em relação ao pico mono-isotópico da amostra controle.

Use essas proporções calculadas para quantificar a quantidade relativa de peptídeo existente em cada modificação. Estado da amostra da reação de desmetilase. A enzima LSD1 pode ser efetivamente utilizada na quantificação por espectrometria de massa da desmetilação de lisina.

Como a reação controle não passa por metilação redutiva, ela indica o envelope isotópico típico para este peptídeo. As áreas dos picos resultantes determinam as proporções de fundo do peptídeo existente em carbono 13 C dois e carbono 13 C quatro. Os estados isotópicos, juntamente com as áreas dos picos do espectro de massas da reação controle, permitem a quantificação da quantidade relativa de peptídeo existente em cada estado de modificação. Na reação de desmetilase, as áreas dos picos dessas reações controle e desmetilase determinam 33,7% de lisina dimetilada em 4, 42,0% de lisina monometilada em 4 e 24% de lisina não metilada em 4.

Essa abordagem de squam em massa oferece insights fundamentais para o campo da epigenética das histonas, como a forma como a desmetilação de resíduos de lisina nas histonas contribui para diversas doenças. Embora este ensaio de metilação tenha sido aplicado para estudar desmetilases, ele também pode ser utilizado para investigar metiltransferases.