Quantitativa, análise em tempo real da Base de Dados de atividade de reparo de excisão em lisados ​​celulares Utilizando Lesão específicos Beacons Molecular

O objetivo geral do experimento a seguir é medir as taxas de reparo de DNA e extratos nucleares celulares em tempo real, utilizando sondas moleculares que fluorescem quando reparadas. As sondas moleculares para reparo por excisão básica são compostas por oligonucleotídeos desoxi em uma estrutura de stem-loop contendo uma lesão de base única, com seis grupos fosfofluoresceína conjugados às extremidades cinco linhas e Dabcil conjugado à extremidade três linhas quando dobradas. A fosfofluoresceína é suprimida de forma não fluorescente pelo Dabcil por meio de transferência de energia de ressonância de Förster.

Para avaliar a atividade de reparo do DNA, as sondas são incubadas com extratos nucleares celulares, que contêm enzimas de reparo. A DNA glicosilase é reconhecida e remove a lesão no DNA da sonda. Os sítios ABA resultantes são substratos para a endonuclease AP um ou ape um. Após o reconhecimento, a APE um cliva a estrutura do DNA no sítio ABA, permitindo que o DNA contendo o seis fam se dissocie livremente da estrutura em alfinete.

A separação do quenchero resulta em um aumento da fluorescência proporcional ao nível de reparo do DNA, que pode ser avaliado em tempo real utilizando uma máquina de PCR quantitativa em tempo real. A capacidade de reparar danos no DNA é crucial para toda célula e todo organismo. Dentre a multiplicidade de vias celulares de reparo do DNA, o reparo de bases excisadas tem como alvo bases danificadas que podem resultar de agressões oxidativas ou químicas; elucidar o papel de elementos celulares individuais que possam influenciar o reparo de bases excisadas é um dos principais objetivos dos nossos estudos em laboratório.

Assim, medir com precisão e sensibilidade a atividade de reparo de DNA tornou-se um interesse em nosso laboratório. Este ensaio pode fornecer esses dados. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como marcação com 32 PN e análise por eletroforese em gel, é que nossa técnica não utiliza substratos radioativos, pode medir taxas de reparo diretamente em tempo real e possui uma faixa dinâmica muito ampla.

Além disso, esta abordagem pode utilizar várias fluoroforas diferentes e/ou lesões na base para determinar a especificidade do substrato. Demonstramos que este ensaio é altamente quantitativo e muito sensível em diferentes condições. Este ensaio de boia molecular de reparo de excisão de base é passível de análise cinética.

A alta sensibilidade e especificidade do ensaio permitem a quantificação precisa da reparação por excisão de bases, sendo portanto útil para triagens de inibidores de reparação ou validação. Além disso, é adaptável para medir atividade de reparação em tecidos e lisados de células tumorais para medições funcionais de biomarcadores. Ao projetar balizas moleculares que serão usadas neste ensaio, considere os seguintes oligonucleotídeos de DNA com 43 bases de comprimento, conforme mostrado aqui.

Trabalhe bem. A sequência de DNA não é única, mas deve permitir a formação de uma estrutura em alfinete de cabelo. Quando dobrada como mostrado aqui, a especificidade é alcançada pela inserção de lesões de bases específicas, como uracila ou tetrahidrofuran.

Na posição X, seis bases a partir da extremidade cinco prima, o teor de GC deve ser de pelo menos 32%, e uma base GB não deve ser colocada na extremidade cinco prima. A fluoresceína seis carboxi ou o seis fam devem ser conjugados à extremidade cinco prima, e a extremidade três prima deve ser modificada com dab sil. Este será o substrato para as proteínas de reparo do DNA garantir a ligação e a atividade das glicosilases.

A posição da lesão foi escolhida para garantir espaço suficiente em relação à estrutura em alça e à extremidade do DNA. O comprimento da haste ou do duplex em alça deve ser de no mínimo 15 pares de bases. O comprimento recomendado para o loop é de 13 bases.

O beacon molecular de controle deve ser idêntico ao beacon molecular experimental, exceto pelo fato de não conter uma lesão no DNA. Portanto, não deve ser reconhecido por enzimas de reparo de DNA. Uma vez que os beacons moleculares estiverem disponíveis, deve-se realizar uma avaliação de qualidade para garantir que os beacons não fluoresçam até serem aquecidos.

E para determinar a temperatura de fusão ideal, todas as etapas durante o procedimento de extração devem ser realizadas em gelo ou a quatro graus Celsius. Para garantir a estabilidade das proteínas, prepare-se para o experimento resfriando previamente. Dois béqueres de um litro por amostra, tampas de diálise, câmaras de diálise, centrífuga micro, tubos, seringas e agulhas.

Rotule tubos cónicos de 15 mililitros e coloque-os no gelo. Aspire o meio de crescimento das células e, em seguida, lave-as duas vezes com 7,5 mililitros de PBS frio após a segunda lavagem. Adicione cinco mililitros de PBS frio a cada placa e utilize um levantador celular para desprender as células da placa.

Transfira as células para um tubo cônico esterilizado de 15 mililitros, resfriado, e em seguida centrifugue a 500 vezes G a quatro graus Celsius por cinco minutos. Após a centrifugação, remova o sobrenadante e estime o volume celular empacotado comparando-o com volumes conhecidos de líquido em tubos semelhantes. Centrifugue os tubos por mais um minuto e então remova o PBS remanescente com uma pipeta resus.

Suspenda o pellet celular em 150 microlitros do reagente de extração nuke buster um para cada 50 microlitros de volume celular compactado. Em seguida, transfira as células re-suspensas para um tubo de 1,5 mililitro previamente resfriado e vortexie por 15 segundos em velocidade alta. Após a vortexiação, incube o tubo em gelo por cinco minutos, vortexie por mais 15 segundos e centrifugue a 13.000 ×g por cinco minutos a quatro graus Celsius.

Após a centrifugação, remova e descarte o sobrenadante, que contém a fração citoplasmática. Ressuspenda o pellet em uma mistura de um microlitro de coquetel de inibidores de protease 100 x ressuspenso, um microlitro de DTT 100 milimolar e 75 microlitros de extrator nuke buster. Reagente dois por 50 microlitros de volume celular empacotado.

Vortexar as células por 15 segundos em velocidade alta. Incubar no gelo por cinco minutos e novamente vortexar por 15 segundos em velocidade alta, centrifugar a 13.000 ×g por cinco minutos a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, usar uma seringa para transferir o sobrenadante, que contém as proteínas nucleares, para uma cassete de diálise deslizante com corte de peso molecular de 7.000.

Em seguida, adicione 500 microlitros de DTT um molar a 500 mililitros de tampão de diálise previamente resfriado e realize a diálise do lisado durante 90 minutos a quatro graus Celsius com agitação suave. Após 90 minutos, transfira a cassete de diálise para um segundo béquer contendo 0,5 litros de tampão de diálise previamente resfriado com DTT e continue a diálise do lisado por 90 minutos a quatro graus Celsius com agitação suave. Após a diálise, o extrato pode ter cristalizado devido a altas concentrações de proteína.

Em seguida, insira uma nova seringa em uma porta diferente daquela usada para injetar a cassete e colete a solução de proteína nuclear dialisada a partir da cassete de diálise. Tente incluir cristais com aspecto turvo ao remover a solução de proteína nuclear dialisada. Aliquote a amostra em tubos de microcentrífuga com 20 microlitros cada, congele rapidamente em gelo seco e, em seguida, armazene a menos 80 graus Celsius até o uso.

Determine a concentração da proteína e realize o controle de qualidade conforme descrito no documento anexo. Para realizar o ensaio com sonda molecular, descongele e dilua os lisados celulares até duas microgramas por microlitro de proteína com tampão básico de reação de reparo por excisão contendo um milimolar de DTT; dilua as sondas moleculares até 200 micromolares com o tampão básico de reação de reparo por excisão. Como o equipamento de PCR em tempo real quantitativo normalmente não é usado como fluorímetro, altere o método de corrida no equipamento de PCR em tempo real quantitativo para coletar dados a cada 20 segundos a 37 graus Celsius por pelo menos 180 ciclos.

Então, a cada 20 segundos durante 15 ciclos, no ponto de fluorescência máxima da sondamolecular, para obter dados para normalização. Ajuste o volume da reação para 25 microlitros. Em seguida, configure o desenho da placa no instrumento utilizando o software da Applied Biosystems, com a curva padrão selecionada como tipo de experimento, e conclua o layout da placa.

Um exemplo é mostrado nesta tabela, que também pode ser encontrado no documento suplementar. Não adicione nada ao poço selecionado como curva padrão. Coloque o tampão básico de reação de reparo por excisão, DTT e lisado celular na concentração de dois microgramas por microlitro, bem como todas as sondas moleculares utilizadas no experimento, sobre gelo.

Em seguida, adicione o DTT ao tampão de reação de reparo por excisão básica para uma concentração final de um milimolar. Pipete 15 microlitros do tampão de reação de reparo por excisão básica com DTT para cada poço de uma placa óptica de Q-R-T-P-C-R compatível em gelo. A seguir, de acordo com o esquema da placa, pipete as sondas para os poços apropriados.

Cada combinação de lisado e sonda molecular ou controle deve ser analisada em triplicata. Por fim, pipete cinco microlitros por poço do lisado nuclear diluído nos poços apropriados. É importante lembrar de manter todos os reagentes da sonda molecular frios e de pipetar os lisados na placa como último passo.

Lembre-se de que os lisados contêm proteínas ativas e começarão a reparar as sondas moleculares assim que forem pipetados na mistura de reação. Portanto, é muito importante manter todos os reagentes frios para minimizar a quantidade de reparo da sonda que ocorre antes de você iniciar as medições. Após a adição de todos os componentes, vede a placa com filme adesivo óptico e misture batendo suavemente na placa.

Em seguida, realize uma rápida centrifugação de dez segundos para reunir as soluções na parte inferior dos tubos ou placa; após a centrifugação, insira a placa na máquina de PCR em tempo real quantitativo e inicie o ensaio. Após a conclusão, exporte os dados brutos preferencialmente em formato Excel e siga as instruções no documento anexo para analisar os dados, uma vez que os cálculos necessários tenham sido realizados. Plote os dados de fluorescência normalizados como percentual de fam livre em função do tempo em segundos em um gráfico de dispersão com os erros correspondentes para avaliar a atividade de reparo do DNA e a qualidade dos extratos nucleares das células LN 4 28 e de uma linhagem celular com superexpressão de MPG designada como LN 4 28 MPG. O ensaio descrito neste vídeo foi realizado utilizando uma sondas molecular contendo o substrato APE um tetra furina como controle positivo.

Como mostrado nesta figura, ambas as linhagens celulares apresentam atividade robusta de APE1, indicada pela inclinação acentuada, e atividade de DNA glicosilase específica para a remoção do substrato MPG. A hipoxantina, indicada como HX, foi medida em lisados nucleares de ambas as linhagens celulares. Cada lisado foi analisado utilizando uma baliza molecular de controle de reparo por excisão de bases ou uma baliza molecular de reparo por excisão de bases para HX; para a baliza controle, LN 4 28 é mostrado em verde e LN 4 28 MPG em roxo para a baliza de hipoxantina.

O LN 4 28 é mostrado em azul e o LN 4 28 MPG é mostrado em laranja. Os resultados são apresentados como A unidades médias de fluorescência e B, a fluorescência normalizada. Um aumento dependente do tempo na fluorescência, indicativo de reparo de HX, ocorreu em cada célula.

O lisado foi incubado com a sonda molecular HX, conforme esperado. A linhagem celular LN 4 28 MPG, indicada pelo traçado laranja, apresentou uma taxa muito maior de reparo, indicada pelo acúmulo mais rápido de fluorescência, em comparação com a linhagem celular parental LN 4 28, que possui quantidade mínima da proteína MPG. Assim, a taxa de reparo de lesões específicas no DNA por proteínas de reparo específicas pode ser medida em tempo real a partir de extratos celulares, com níveis mínimos de fundo de clivagem não específica do DNA.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como projetar suas sondas moleculares e medir as taxas de reparo do DNA em tempo real utilizando proteínas purificadas ou lisados celulares. Em relação à análise, é essencial avaliar a faixa dinâmica e os valores de fundo; para isso, inclua reações controle, como as com ou sem as sondas controle positivo e negativo. Considerando a variabilidade entre poços, é útil normalizar os dados dos poços individuais em relação aos valores de entrada.

Esses são determinados pelo passo mais fino na temperatura de fusão. Isso, juntamente com a inclusão de outros corantes como um corante rock, levará em conta a variabilidade inerente a erros de pipetagem ou diferenças em detectores. Esta técnica permitiu-nos elucidar a influência dos componentes individuais da reparação por excisão na atividade e capacidade gerais de reparação.

É sensível o suficiente para revelar pequenas alterações que não teriam sido detectáveis com métodos convencionais.