Microscopia intravital do Baço: Análise Quantitativa da Mobilidade Parasite e do fluxo sanguíneo

Neste procedimento, apresentamos uma abordagem quantitativa de microscopia intravital para avaliar a dinâmica da passagem do parasita pelo baço. Em um modelo de malária em roedor, camundongos infectados com parasitas transgênicos GFP são preparados para microscopia intravital, e a canulação da veia esplênica permitirá a injeção de corantes intravitais. Durante o experimento, células fluorescentes são visualizadas em movimento em diferentes regiões do baço.

Apresentamos a metodologia para descrever a mobilidade do parasita no compartimento lento tridimensional do baço e calcular o fluxo sanguíneo nos vasos. Esses parâmetros foram utilizados para comparar a dinâmica esplênica de duas linhagens de PULE. Olá a todos.

Meu nome é Nando El Portillo e uma das principais questões de pesquisa no meu laboratório é tentar compreender o papel do baço na malária. A esplenomegalia é um dos marcos desta doença, mas devido a questões técnicas e éticas, realizar estudos sobre este órgão é muito difícil. Para tanto, desenvolvemos tecnologias que nos permitem observar a passagem dinâmica deste parasita e quantificar esse fenômeno.

É isso que Lorena e MI explicarão nestes protocolos. Esta pesquisa está sendo conduzida em parte em colaboração com os grupos do Dr. Ler, da Universidade de Hamburgo, na Alemanha, e da Dra. Maria Kbo aqui no Hospital Clínic, e recebeu financiamento geral da fundação Cellex e do órgão ministerial CIA. A infecção em espanhol é iniciada a partir de um doador M infectado com parasitas GFP letais ou não letais a 10% de parasita. Para verificar o parasita, retire uma pequena gota de sangue da veia da cauda do camundongo e estenda-a sobre um microscópio.

Deslize uma coloração métrica com GIMs. Uma solução permitirá a visualização de hemácias infectadas após secagem; fixe o esfregaço sanguíneo com metanol por dois minutos, aplique a solução de GIMs e incube por 20 minutos. Lave a lâmina com água corrente da torneira e seque. Enumere a porcentagem de GBs sobre o total de hemácias utilizando um microscópio óptico com objetivo de 100x com imersão em óleo.

Infecte camundongos com parasitas letais ou não letais obtidos do sangue da cauda de camundongos doadores diluídos em PBS. Ajuste a dose para injetar meio milhão de parasitas por camundongo, a fim de atingir um parasita periférico de 1% no terceiro dia pós-infecção, e injete por via intraperitoneal. Alternativamente, hemácias marcadas com FITC podem ser usadas como controle.

Os animais coletam um mililitro de sangue arterial de um camundongo e lavam o pellet por centrifugação em PBS contendo EDTA, seguido pela incubação em solução de FITC por duas horas no escuro com agitação suave. Após esse período, remova o sobrenadante por centrifugação e lave extensivamente. Injete em um camundongo controle para atingir em média 1% na circulação periférica e prossiga para experimentos in vivo.

Olá, eu sou a Mija. Para obter imagens do baço in vivo, precisamos realizar uma pequena cirurgia no animal para expor o baço; obviamente, nesta técnica. Aprendi com Stephanie GR no laboratório de Worker Heisler, a quem gostaria de agradecer, e agora vou mostrar a vocês como proceder.

Imagem do mioma infectado realizada no terceiro dia pós-infecção, quando a parasitemia é de 1% em ambas as cepas. Mantenha o camundongo anestesiado e em temperatura regulada durante todo o procedimento. Proteja os olhos da desidratação e verifique se o camundongo está completamente anestesiado pressionando a planta do pé antes de prosseguir, a fim de facilitar a administração intravenosa de substâncias.

Durante o experimento, cânule a veia da cauda do camundongo para construir a cânula. Insira uma agulha pequena em uma extremidade de um tubo e seu aplicador na outra extremidade. Encha a cânula com solução salina fisiológica removendo as bolhas e verifique se a solução flui corretamente através da cânula.

A veia lateral da cauda será canulada com precisão. Aumente sua visibilidade fazendo uma leve constrição na base da cauda. Introduza a ponta da cânula dentro da veia.

A presença de sangue indicará que a agulha está bem posicionada. Caso contrário, repita a canulação a montante da veia, em seguida fixe a cânula à cauda usando cola e fita adesiva. Exponha a parte inferior do baço por meio de uma pequena incisão na pele e na musculatura do lado dorsal esquerdo do animal.

Posicione um baço onde menos movimento respiratório é observado e aplique PBS sobre a superfície exposta para mantê-lo livre dos pelos do camundongo e hidratado. Sobre o baço, coloque um lamínula para permitir a visualização. Olá, meu nome é Lorena.

O protocolo mostrado permitirá visualizar o movimento de parasitas PULI através do baço. Isso foi possível graças a parasitas transgênicos GFP. Doação gentil de James Burnes da Universidade Drexel.

A imagem do movimento de parasitas fluorescentes nos permitirá saber se existem diferenças no comportamento entre cepas letais e não letais. Os experimentos de microscopia intravital foram realizados em um microscópio multiphotônico Leica, equipado com um sistema de incubação com controle de temperatura e uma objetiva de glicerol de 63 x. Coloque o animal sobre a platina do microscópio com uma lamínula cobrindo o baço voltado para baixo, em direção à objetiva. Inicialmente.

A visualização do baço em aumentos menores fornecerá uma visão geral da estrutura microcirculatória do órgão. Foque o baço utilizando a autofluorescência do tecido; parasitas GFP são observados passando pelas diferentes áreas do baço. Olá, meu nome é Maria Albo dos Centros Científicos e Tecnológicos da Universidade de Barcelona, e realizaremos imagem intravital do baço.

Para estudar o fluxo sanguíneo e a mobilidade de hemácias infectadas, utilizaremos um microscópio confocal equipado com varredura ressonante, que permite imagens de alta velocidade, muito úteis para evitar o movimento do órgão. Trata-se de um microscópio espectral que permite selecionar a faixa de visão. Para obter imagens muito rapidamente, realizaremos a aquisição simultânea das duas marcações com fluoresceína e da reflexão.

Selecione diferentes zonas para imagem com a ajuda de hemácias, reflexão, contraste e corantes Vidal para evidenciar a microvasculatura do baço. Agora explicaremos como medir a mobilidade do parasita no fluxo sanguíneo dos vasos utilizando microscopia Vidal e o software ImageJ para acompanhar o movimento do parasita na rede tridimensional da polpa vermelha. Adquira imagens através de cinco profundidades Z usando um modo de varredura de alta velocidade.

Converta pilhas de imagens em filmes coloridos codificados por Z para facilitar o rastreamento de células fluorescentes individuais. Informações detalhadas são fornecidas no texto para rastrear diferentes partículas ao longo do tempo em profundidade em cada vídeo; utilizando as coordenadas X, Y, Z e T, parâmetros de mobilidade como direcionalidade, velocidade média e tempo de residência podem ser calculados e representados como mapas de distribuição para permitir análise comparativa entre populações de cepas. O fluxo vascular no baço pode ser visualizado por injeção sistêmica de várias moléculas fluorescentes descritas na tabela suplementar, como a dextrina.

E, utilizando o contraste de reflexão de eritrócitos endógenos, escaneie o fluxo sanguíneo da linha central ajustando os vasos horizontalmente na direção da varredura a laser e usando a média de linhas aprimorada. Nessas imagens, as trilhas resultantes das células em movimento serão usadas para calcular o fluxo sanguíneo; obtenha imagens de vasos com diferentes diâmetros e ao longo do ciclo cardíaco para compensar flutuações. O baço tem sido há muito considerado uma caixa preta na pesquisa da malária, e aqui desenvolvemos uma abordagem quantitativa de microscopia intravital para obter informações sobre a dinâmica da infecção parasitária e do fluxo sanguíneo neste órgão, permitindo-nos responder a questões biológicas importantes, como a aderência in vivo de hemácias infectadas ao baço.

Obrigado e.