Métodos de auto-administração intravenosa em um modelo de camundongo
8 de dezembro de 2012
A auto-administração intravenosa paradigma (IVSA) é considerado como sendo o padrão de ouro para examinar as propriedades de reforço de drogas de abuso em roedores. Este manuscrito descreve os procedimentos experimentais e técnicas cirúrgicas necessárias para a obtenção de dados confiáveis IVSA. Em particular, a implantação do cateter meticulosa e manutenção são realçados.
Olá, meu nome é Elizabeth Kotick e estou aqui do laboratório da Dra. Katherine Gill, da unidade de dependências do Centro de Saúde da Universidade McGill. Hoje vou mostrar como realizar a cirurgia de cateterização necessária para conduzir estudos de automedicação intravenosa. Vou demonstrar como inserir o cateter, bem como algumas dicas para manter a perviedade do cateter.
Durante as sessões de automadministração intravenosa de nicotina, os animais são conectados ao Tai por meio de tubos de plástico e as infusões de nicotina são administradas pelas bombas de infusão acopladas. As caixas operantes foram adquiridas da Med Associates. Cada caixa é equipada com duas alavancas ultrasensíveis para camundongos.
Existem alguns itens que precisam ser preparados previamente à cirurgia para inserir o cateter na veia. Uma agulha de 20 gauge precisa ser adaptada para deslizar o tubo para dentro da veia. Apare cerca de dois centímetros da parte superior da haste da agulha, criando um canal que será usado para guiar o tubo do cateter para dentro da veia.
Em seguida, prepare as seringas para lavagem e verificação do cateter. Doze centímetros de tubo são fixados em uma extremidade à agulha de 26 gauge da seringa, enquanto a outra extremidade é esticada sobre uma agulha de 23 gauge. Para facilitar a fixação do tubo ao cânula do cateter, você precisará de duas seringas como esta: uma preenchida com a solução heparinizada de T carcin, e a outra com soro fisiológico.
Por fim, prepare a tampa da cânula do cateter. A cânula do cateter precisa ser tampada para evitar a entrada de detritos. Essas tampas são feitas esticando tubos plásticos sobre agulhas de calibre 23.
O tubo é cortado a um centímetro da ponta da agulha e a extremidade aberta é aquecida para selar o tubo; em seguida, soro fisiológico é empurrado através da agulha para garantir que não haja vazamentos nas tampas. Cateteres para camundongos foram obtidos da Cam Cs no Reino Unido. Corte o excesso de tubo do cateter de modo que reste 1,2 centímetro da extremidade da lâmpada do cateter.
Em seguida, conecte a seringa contendo soro fisiológico à cânula metálica externa do cateter e realize uma lavagem para inspecionar vazamentos. Os camundongos são anestesiados usando gás isoflurano misturado com oxigênio e permanecem sob anestesia durante toda a cirurgia. Utilizando um tubo de respiração, os níveis de oxigênio e isoflurano são ajustados com base no peso corporal do animal e são modificados conforme necessário durante a cirurgia; certifique-se de que o animal está adequadamente anestesiado pinçando suas patas traseiras com a pinça e monitore o camundongo durante toda a cirurgia quanto a sinais de dificuldade respiratória e profundidade da anestesia.
Como a cirurgia dura entre 20 e 30 minutos, aplique um lubrificante ocular em ambos os olhos. O camundongo é depilado antes da cirurgia. Prepare um espaço para a base do cateter nas costas do animal.
Puxe suavemente a pele nas costas do animal e faça uma pequena incisão longitudinal na região interescapular com cerca de dois centímetros de comprimento, começando na metade das costas e estendendo-se logo abaixo do pescoço. Separe a força o tecido conjuntivo para criar espaço para a base do cateter e aplique soro fisiológico na incisão.
Puxe suavemente a pele em ambos os lados da incisão, juntando-as, e vire o animal. A veia tegular direita estará localizada superficialmente sob a pele do pescoço e pode ser exposta mediante uma incisão rasa em forma de S. Faça um corte diagonal com cerca de um a dois centímetros de comprimento, estendendo-se a partir da região da clavícula direita, seguindo diagonalmente em direção à mandíbula do animal.
O tubo proveniente da base do cateter precisa ser conduzido através da incisão ventral no pescoço para ficar acessível à inserção na veia. Conduza a pinça sob a pele dos ombros e rompa o tecido conjuntivo. Para alcançar a incisão dorsal, puxe o tubo através da pele até a abertura ventral ao redor do pescoço do animal.
Segure a extremidade do tubo com pinças de artéria e mantenha-a presa ao lado direito do animal. Aplique soro fisiológico na incisão e isole a veia jugular direita. Remova com muito cuidado qualquer tecido conjuntivo ou adiposo que possa estar obstruindo a sua visão e localize a veia.
Eleva suavemente a veia ao redor da parte superior e use a pinça curva para separar o tecido adiposo e o tecido conjuntivo ao redor e sob a veia. Coloque a pinça curva sob a veia e abra-a com a mão livre. Passe uma barra plástica estéril sob a veia.
Uma vez que a veia esteja elevada, remova apenas a quantidade necessária de gordura para obter uma visão clara e desobstruída da veia. Periodicamente, pingue solução salina sobre a veia exposta para mantê-la úmida. Prepare nós de sutura ao redor da veia para poder fixar o tubo do cateter no lugar assim que for inserido na jugular.
Suture abaixo da veia em ambas as extremidades e faça um único nó solto aberto em cada extremidade. Passe o cateter através do nó superior e enrole-o ao redor do fio de sutura, deixando o restante sobre o ombro direito. Passe soro fisiológico pelo cateter para pesar o tubo e facilitar a inserção do cateter na veia jugular.
A agulha modificada de calibre 20 é usada para perfurar a veia; umedeça tanto a veia quanto a agulha de inserção com soro fisiológico para reduzir o atrito durante a inserção, puxe suavemente para trás a barra plástica e insira a agulha mais próxima da parte inferior da veia. Apenas o suficiente para que meio centímetro da agulha fique inserido. Deslize o tubo do cateter pela agulha e para dentro da veia.
Não deve haver resistência. A resistência indicaria que você está em tecido conjuntivo. Para ter certeza de que está dentro da veia, tente puxar o êmbolo da seringa do cateter para verificar se é possível aspirar sangue.
Uma vez que o tubo esteja no lugar, remova a agulha e empurre a bolha do cateter até o ponto de inserção. Dê o nó inferior e certifique-se de que o tubo do cateter esteja bem encostado na barra antes de dar o segundo nó logo acima da bolha. Isso fixará o cateter no lugar.
Remova a barra e faça um segundo nó em cada extremidade. Posicione o tubo do cateter e os fios de sutura sob a pele antes de suturar. Use o prendedor arterial para guiar a agulha de sutura através da pele e fechar a incisão.
O número de pontos variará conforme o tamanho da incisão. Com o animal em posição ventral, posicione a base do cateter nas costas do animal. Aplique solução salina na incisão e deslize a base do cateter sob a pele.
Certifique-se de que o tubo esteja com o mínimo de voltas e posicionado sob a base para minimizar as chances de perfuração. Suture a pele ao redor da base do cateter. O número de pontos dependerá do tamanho da incisão.
Normalmente, três a quatro pontos são suficientes. Certifique-se de que ainda seja possível aspirar sangue pelo cateter. Por fim, lave o cateter com a solução de teína heparinizada para prevenir infecção e formação de coágulos sanguíneos.
Solte o tubo conectado à cânula do cateter. Em seguida, remova o tubo de soro fisiológico e substitua-o rapidamente pelo tubo da seringa contendo a solução heparinizada de T Carin. Lave o cateter com 0,03 a 0,05 cc da solução.
Novamente, solte o tubo conectado à cânula. Segure a tampa do cateter com a pinça e, com um único movimento, remova o tubo da cânula e substitua-o pela tampa do cateter. Este passo deve ser feito rapidamente para evitar que o sangue suba.
Parafuse a tampa branca do cateter, certificando-se de que ela esteja firme sem perfurar a ponta da cânula. Administre ao camundongo injeções subcutâneas de analgésico e antibiótico. Injete o analgésico cetoprofeno em um dos lados na dose de cinco miligramas por quilograma e o antibiótico amicacina no outro lado na dose de 10 miligramas por quilograma.
Após a interrupção da anestesia, permita que o camundongo se recupere em uma gaiola limpa com fácil acesso a comida e água. Dados confiáveis de autoadministração intravenosa podem ser obtidos seguindo as técnicas apresentadas neste vídeo. No entanto, é importante manter a pervia do cateter.
Isso é conseguido por meio da colocação cuidadosa do cateter no átrio direito, da lavagem diária do cateter antes e depois das sessões cirúrgicas e da garantia de que a cânula do cateter esteja constantemente tampada para evitar a entrada de detritos.
Visão Geral
Este artigo detalha o paradigma de automedicação intravenosa (IVSA), um método padrão para estudar o reforço farmacológico em roedores. Ele enfatiza as técnicas cirúrgicas e os procedimentos necessários para obter dados confiáveis de IVSA, com foco particular na implantação e manutenção do cateter.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Neurociência
- Farmacologia Comportamental
- Modelos com Roedores
Contexto Geral
- IVSA é um método amplamente utilizado para avaliar as propriedades reforçadoras de drogas.
- A coleta confiável de dados é fundamental para compreender os mecanismos da dependência.
- Técnicas cirúrgicas adequadas são essenciais para o implante bem-sucedido do cateter.
- A manutenção da patência do cateter é crucial para a integridade experimental.
Objetivo do Estudo
- Descrever os procedimentos para cirurgia de cateterização em roedores.
- Fornecer dicas para manter a funcionalidade do cateter durante os experimentos.
- Aprimorar a confiabilidade da coleta de dados em estudos de administração intravenosa (IVSA).
Métodos Utilizados
- Preparação dos instrumentos cirúrgicos e materiais para a inserção do cateter.
- Passos detalhados para o implante do cateter na veia jugular.
- Monitoramento da anestesia e das condições cirúrgicas durante o procedimento.
- Técnicas para garantir a perviedade do cateter e prevenir obstruções.
Resultados Principais
- Foram demonstradas técnicas bem-sucedidas de implante de cateter.
- Foram descritas diretrizes para manter a perviedade do cateter.
- Foram fornecidos passos cirúrgicos detalhados para garantir a reprodutibilidade.
- Ênfase no monitoramento do bem-estar animal durante o procedimento.
Conclusões
- Técnicas cirúrgicas adequadas são fundamentais para estudos confiáveis de IVSA.
- Manter a funcionalidade do cateter é essencial para a integridade dos dados.
- Este estudo serve como um guia abrangente para pesquisadores da área.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A autoadministração intravenosa (IVSA) em modelos de camundongos fornece uma plataforma pré-clínica essencial para avaliar as propriedades reforçadoras de compostos, permitindo a validação de alvos na descoberta de fármacos para dependência e transtornos neuropsiquiátricos. Ao permitir que os animais autoadministrem substâncias-teste, este método reduz o viés do experimentador e gera dados quantitativos sobre os padrões de consumo de drogas, apoiando a desmistificação mecanicista e aumentando a confiança preditiva na avaliação inicial de alvos. A abordagem facilita a continuidade translacional do engajamento do alvo até a saída comportamental, orientando decisões de avançar ou não avançar na priorização de portfólios para terapêuticas do sistema nervoso central.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas mediante a medição da ingestão voluntária de drogas como indicador funcional do engajamento do alvo em vias de recompensa.
- Valor Operacional: Apoia a redução de riscos biológicos por meio da avaliação direta do reforço do composto, esclarecendo precocemente a responsabilidade do alvo e o potencial de abuso durante a fase de descoberta.
- Valor Preditivo: Gera medidas quantitativas de variáveis dependentes (por exemplo, frequência de infusões, padrões de consumo) que auxiliam na confiança preditiva e na triagem de portfólios para moléculas direcionadas ao sistema nervoso central.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Prepara sistemas biológicos validados para avaliação de compostos posteriores, estabelecendo entrega confiável de fármacos por cateter e resposta estável na linha de base.
- Reprodutibilidade: Enfatiza técnicas cirúrgicas padronizadas e protocolos de manutenção de cateteres para garantir resultados quantitativos consistentes entre experimentos e laboratórios.
- Utilidade da Plataforma: Permite triagem confiável de compostos por meio da medição precisa do momento e da quantidade de consumo de fármaco, apoiando a escalabilidade do ensaio e seu reuso em testes de reforço.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para a Doença: Modela o comportamento humano de automedicação, fornecendo um sistema relevante para a doença no estudo dos mecanismos de dependência e na avaliação de intervenções terapêuticas.
- Continuidade Translacional: Conecta descoberta e trabalho pré-clínico ao oferecer um ensaio comportamental consistente que pode ser utilizado nas etapas de validação de alvos e otimização de compostos líderes.
- Avanço com Ajuste de Risco: Orienta decisões pré-clínicas de seguir/não seguir ao identificar compostos com perfis indesejáveis de reforço, reduzindo a desistência em fases tardias devido à suscetibilidade ao abuso.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
IVSA se integra ao continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a identificação de compostos promissores e avaliação pré-clínica, servindo como um ensaio funcional para a avaliação de dependência que complementa os perfis farmacocinéticos in vitro e in vivo.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a clarificação de vias ao associar alvos moleculares ao comportamento motivado por meio de resultados de automadministração.
- Triagem: Oferece prontidão para ensaios e saídas quantitativas (por exemplo, taxa de infusão, ponto de interrupção sob razão progressiva) que permitem comparação confiável de compostos em teste com controles.
- Análises: Fornece capacidades de análise estatística para comparar condições, como consumo ao longo do tempo ou padrões de resposta, essenciais para avaliar os efeitos e a variabilidade dos compostos.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica ao manter uma leitura comportamental consistente que se alinha com desfechos clínicos relacionados ao uso de drogas e recaída.
- Reutilização Empresarial: Funciona como uma plataforma reutilizável em múltiplos projetos e séries de compostos, reforçando a padronização e a comparabilidade entre estudos na pesquisa sobre dependência.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade mecanicista por meio da medição comportamental direta do reforço.
- Valor Operacional: Promove padronização e reprodutibilidade por meio de procedimentos cirúrgicos detalhados e de manutenção de cateteres, minimizando a variabilidade técnica.
- Valor Estratégico: Melhora a tomada de decisões de avanço ou interrupção ao identificar precocemente o potencial de abuso, aumentando a eficiência do capital e reduzindo riscos biológicos em estágios avançados em programas do SNC.
- Impacto sobre o Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco ao identificar compostos com alto potencial de reforço, apoiando decisões informadas de avanço.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em cirurgia de roedores, técnicas de cateterização e monitoramento anestésico para garantir o bem-estar animal e o sucesso do procedimento.
- Depende de instrumentação especializada, incluindo bombas de infusão, câmaras operantes com alavancas ultra-sensíveis e instrumentos cirúrgicos estéreis para posicionamento consistente do cateter.
- Necessita padronização entre equipes dos protocolos de lavagem, tampagem e manutenção de cateteres para prevenir obstruções e assegurar a integridade dos dados entre estudos.
- Envolve considerações de adaptação para diferentes linhagens de camundongos, tipos de cateter e formulações de fármacos, com atenção ao acesso venoso e à perviedade do cateter ao longo do tempo.
- Inclui limitações práticas, como complicações relacionadas ao cateter (por exemplo, infecção, trombose), que exigem monitoramento rigoroso e podem afetar a coleta de dados longitudinais.
