Microdiálise de etanol durante a operante determinação auto-administração de etanol e etanol por cromatografia gasosa

O objetivo geral deste procedimento é monitorar os níveis de etanol no dialisato cerebral durante uma sessão de autoministração de etanol. Para comparar essa medida com os comportamentos de autoministração simultâneos, realiza-se primeiramente a implantação cirúrgica de uma cânula-guia de microdialisato, cânula e parafuso de fixação, seguida pelo treinamento de ratos para autoministrar etanol por meio operante. O segundo passo consiste em habituar os ratos ao suporte de fixação craniano, de modo que este não interfira na autoministração de etanol durante a microdialisato.

Em seguida, realiza-se a microdiálise durante uma sessão de autoministração de etanol, na qual uma porção do dialisato é preparada para análise de etanol. A seguir, as amostras de dialisato são analisadas quanto à concentração de etanol utilizando um cromatógrafo a gás com detecção por ionização de chama. Por fim, os resultados obtidos mostram a cinética de chegada do etanol à região cerebral de interesse durante uma sessão de autoministração de etanol.

A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a punção da cauda ou da veia safena, é que este procedimento é minimamente invasivo no momento da coleta da amostra e permite a medição de fármacos ao longo do tempo na região cerebral de interesse enquanto o animal realiza uma tarefa comportamental. Geralmente, indivíduos novos nesta técnica terão dificuldades, pois ela exige uma série de habilidades especializadas, muitas das quais só podem ser adquiridas mediante prática ou experiência repetida. Também demonstrará o procedimento Jeffrey Dilley, um assistente de pesquisa de graduação em nosso laboratório.

Todos os procedimentos com animais mostrados são aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais da Universidade do Texas e seguem todas as orientações para o cuidado e uso de animais de laboratório. A Universidade do Texas em Austin é uma instalação credenciada pela ALAC que utiliza ratos Long Evans bem manuseados, os quais foram cirurgicamente implantados com uma cânula de 21 gauge acima da região cerebral de interesse, para esses experimentos comportamentais de microdiálise. Todos os animais devem receber pelo menos uma semana de cuidados pós-cirúrgicos e recuperação, e devem estar saudáveis antes de iniciar os procedimentos a seguir.

Coloque a rata em uma câmara operante da Med Associates, equipada com uma alavanca retrátil Lichter e um tubo dosador, e treine-a a pressionar a alavanca para obter acesso a uma solução de sacarose a 10%. Após o rato ser treinado para responder pela solução de sacarose, inicie-o em um cronograma de treinamento apropriado, durante o qual o etanol é gradualmente adicionado à solução ao longo de múltiplas sessões de ingestão na noite anterior à penúltima sessão operante. Após anestesiar o animal e verificar o nível de sedação, prenda a mola do cânula ao parafuso do cânula no suporte craniano do rato para habituá-lo ao aparelho, que consiste em uma alavanca de contrapeso, braço, cânula rotativa, mola e suporte de anéis.

Deixe a rata passar a noite na sala de condicionamento operante, dentro de sua gaiola com acesso livre a alimento e água, e então realize a sessão de treinamento do dia seguinte com o cânula e equipamentos associados posicionados no dia anterior ao experimento de microdiálise. Após anestesiar a rata com isoflurano, verifique a sedação realizando um aperto no dedo do pé e insira uma sonda de microdiálise perfundida com fluido céfalo-raquidiano artificial. Fixe adequadamente a sonda e, em seguida, ajuste a taxa de fluxo da sonda para 0,2 microlitros por minuto.

Coloque a rata em sua gaiola de origem na sala operante para passar a noite com todo o equipamento de diálise no lugar e forneça à vontade alimento e água. No dia seguinte à inserção da sonda, pelo menos duas horas antes do início do experimento, aumente a vazão da sonda até sua taxa de funcionamento. Utilizando uma seringa Hamilton, verifique se a vazão da sonda é constante e está pelo menos em 90% da taxa de fluxo definida.

Se for avaliar neurotransmissores nas amostras de diálise, colete amostras durante todas as fases do experimento. Comece coletando amostras de diálise enquanto o animal estiver em sua gaiola de origem. Armazene as amostras de maneira apropriada para análises posteriores.

Transfira cuidadosamente a rata para a câmara operante e inicie o programa operante que controla a câmara. Continue coletando amostras enquanto a rata aguarda a extensão da alavanca para dentro da câmara, coletando duas amostras antes da alavanca se estender. Comece a coletar uma fração de cada amostra de dialisado para análise de etanol pipetando uma alíquota apropriada do dialisado em um frasco de vidro de dois mililitros e selando o frasco com uma septa hermética, pipete e selando rapidamente as amostras de etanol.

Como o etanol é volátil e o volume da amostra é pequeno, uma preparação inconsistente ou lenta da amostra levará a resultados imprecisos. Armazene o restante para análise de neurotransmissores. O período de ingestão de 20 minutos começa após o programa de computador da Med Associates estender a alavanca na câmara e a ratazana pressioná-la para obter acesso a uma garrafa com solução para ingestão.

Continue a coletar amostras durante todo o período de ingestão da bebida; após esse período, o programa de computador retira a garrafa da câmara. Mantenha o animal na câmara por um período adicional de 20 minutos após a ingestão, ao final do experimento de microdiálise. Após anestesiar a rata, remova a sonda.

Se o animal não for eutanasiado de forma humanitária imediatamente, substitua o obturador para garantir a visualização do trajeto da sonda. Colete o cérebro dentro de três dias após o experimento. Analise as amostras juntamente com padrões externos de etanol utilizando um cromatógrafo a gás com detector de ionização de chama, um amostrador automático de fase de cabeça aquecido a 50 graus Celsius e uma coluna capilar com hélio como fase móvel.

Para registrar e analisar os cromatogramas, utilize um software de estação de trabalho cromatográfica para preparar o sistema para análise de etanol. Use um banho de água com recirculação para aquecer a placa do amostrador automático e abra os cilindros de ar e hidrogênio. Em seguida, inicie o programa de inicialização.

Quando estiver pronto, inicie uma queima de 20 minutos, a qual descontamina a fibra. Prepare padrões utilizando um balão volumétrico de 100 mililitros para diluir 238 microlitros de etanol 95% com água até um volume final de 100 mililitros. Utilize uma diluição seriada um para um para criar os padrões.

Pipete os padrões em vials de vidro e feche-os exatamente como foram preparadas as amostras. Certifique-se de incluir um branco de água junto com seus padrões. Coloque os padrões e as amostras na bandeja do amostrador automático e aqueça-os até que toda a alíquota líquida tenha sido vaporizada.

Para executar os padrões e as amostras, crie uma lista de amostras indicando qual amostra está em cada posição do amostrador automático e observando que cada amostra deve ser perfurada. Depois de direcionar os arquivos de dados para uma pasta selecionada, escolha um método apropriado para as amostras e inicie a execução. Após o sistema ter processado as amostras, verifique se o programa integrou corretamente cada pico.

Trace o gráfico da altura do pico em função de cada padrão externo conhecido. Concentração de etanol. Utilize a função linear fornecida pelos pontos para interpolar a concentração de etanol em cada amostra de dialisato.

Esta figura mostra cromatogramas de exemplo para três concentrações de padrões de etanol e um de uma amostra de dialisado de rato coletada ao final da sessão de automedicação de etanol. Os picos de etanol devem ser relativamente simétricos, apresentar tempos de retenção consistentes e uma relação sinal-ruído superior a 10. O não cumprimento desses critérios indica que o sistema necessita de manutenção, cromatografia de qualidade e padrões corretos, que produzem uma curva padrão linear utilizada para calcular a concentração de etanol nas amostras de dialisado coletadas de animais que se automedicam com etanol ao longo da sessão de automedicação.

As concentrações de etanol no dialisato derivado não são corrigidas pela recuperação do sonda in vivo e representam apenas uma fração da concentração tecidual de etanol no cérebro. Se for necessária microdiálise quantitativa de etanol, a fração de extração do etanol que difunde do espaço extracelular para dentro da sonda é determinada experimentalmente. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em aproximadamente quatro a cinco horas, se for executada corretamente.

Isso variará com base na duração da sessão comportamental. A conclusão bem-sucedida da fase de microdiálise do experimento depende grandemente da qualidade das fases preparatórias. Ao tentar realizar este procedimento, é importante garantir que seus ratos sejam bem manipulados e que tenham sido habituados a quaisquer estímulos potencialmente perturbadores que possam ocorrer durante o experimento de diálise, de modo que o comportamento de automedicação do animal não seja afetado.