Microarray de anticorpos quimicamente bloqueada para Multiplexed perfil de alta capacidade de glicosilação proteína específica em amostras complexas

Este artigo em vídeo descreve um procedimento para obtenção de perfis de glicosilação de 20 glicoproteínas diferentes em uma amostra de soro de paciente com carcinoma hepatocelular, utilizando um microarranjo de anticorpos previamente bloqueado quimicamente. Primeiramente, anticorpos específicos para glicoproteínas são impressos diretamente em lâminas de microarranjo e os glicanos dos anticorpos são bloqueados para impedir a ligação de lectinas. Quando as amostras de soro do paciente são aplicadas, as glicoproteínas da amostra são capturadas pelos anticorpos. Em seguida, são adicionadas proteínas ligadoras de glicanos biotiniladas para detectar os glicanos, e estreptavidina conjugada é adicionada para marcar as lectinas biotiniladas.

O lâmina de microarranjo é então escaneada para detectar a fluorescência, e a análise dos dados resultantes revela os perfis de glicosilação das proteínas da amostra. Esta técnica apresenta diversas vantagens em comparação com métodos existentes, como a CLAE. Este método permite a detecção de glicoproteínas individuais em seu estado nativo.

É mais rápido e fácil realizar a triagem de alterações na glicosilação para múltiplas proteínas simultaneamente. Descobrimos que os biomarcadores de doenças, particularmente de câncer e câncer de fígado, que analisamos com maior cuidado, frequentemente são glicosilados. E verificamos que a capacidade de detectar formas glicossiladas específicas melhora significativamente o desempenho dos biomarcadores em termos de sensibilidade e especificidade.

Portanto, esta medida pode fornecer informações sobre alterações na glicosilação de múltiplas proteínas séricas no CHC. Também pode ser aplicada ao estudo de patologia e à descoberta de biomarcadores em outros cânceres e doenças, como câncer pancreático, diabetes e doença de Alzheimer. O procedimento será demonstrado por Chen Lu, um técnico do meu laboratório.

Inicie este protocolo preparando primeiro o micromatriz de anticorpos em tubos microcêntrifugos de 0,8 mililitro mantidos no gelo, diluindo todos os anticorpos que serão utilizados para impressão da micromatriz até uma concentração de 0,5 miligrama por mililitro em um volume mínimo de 40 mililitros de PBS. Aqui, 26 anticorpos diferentes serão usados como controle positivo. Prepare também a mesma quantidade de BSA biotinilada a 0,5 miligrama por mililitro em PBS. Utilize uma pipeta para aliquotar 40 mililitros de cada anticorpo na placa fonte de 384 poços mantida no gelo.

Em seguida, no software de controle do microarranjo, defina a localização de cada anticorpo. Depois, carregue a placa no microarranjo como fonte. Em seguida, carregue 20 lâminas de microarranjo de caminho no microarranjo como alvo.

Configure a micromatriz para imprimir 48 subarranjos idênticos nos quais 27 anticorpos e proteínas controle são depositados em triplicata em um padrão de nove por nove. Inicie a micromatriz para imprimir as lâminas de micromatriz de anticorpos. Colete as lâminas de micromatriz de anticorpos e armazene-as em um cassete para lâminas com dessecante.

Feche o cassete em um saco plástico para prevenir a desnaturação proteica e a umidade nas lâminas durante o armazenamento. Armazene as lâminas de microarranjo lacradas a quatro graus Celsius até o momento de uso. O aspecto mais difícil e importante deste procedimento é a etapa de bloqueio químico.

Para garantir o sucesso, é fundamental que uma quantidade suficiente de anticorpo seja impressa no microarranjo luminoso. Sempre prepare o IDE de sódio e o hidrocito ácido agrólico frescos imediatamente antes do experimento. E certifique-se de realizar o procedimento de oxidação a quatro graus, evitando a luz.

Retire as lâminas de microarranjo do refrigerador e deixe-as equilibrar à temperatura ambiente por 30 minutos. Remova uma lâmina da caixa de armazenamento. Mergulhe brevemente a lâmina em uma bacia contendo PBS com 0,1% de tween 20.

Em seguida, mergulhe a lâmina em tampão de acetato de sódio 15 milimolar com 0,1% de tween por 10 minutos. Em seguida, prepare uma solução fresca de periodato de sódio 150 milimolar em tampão de acetato de sódio 15 milimolar e transfira-a para uma cuba de lavagem de lâminas. Armazene em geladeira, protegido da luz, até o uso. Remova a lâmina do tampão de acetato de sódio e coloque-a na cuba contendo periodato de sódio fresco com o lado do anticorpo voltado para cima.

Cubra a cuba com papel alumínio para evitar a luz. Em seguida, coloque a cuba com lâminas a quatro graus Celsius com agitação suave por duas horas. Remova a lâmina da cuba e enxágue brevemente em tampão de acetato de sódio três vezes por cinco minutos.

Incube o lâmina em 300 mililitros de solução bloqueadora de ácido hidroglutâmico 10 milimolar recém-preparada em uma câmara de incubação por duas horas à temperatura ambiente com agitação suave. Remova as lâminas da câmara e lave-as com PBS contendo 0,1% de tween por três minutos. Em seguida, em uma cuba para lavagem de lâminas, incube a lâmina de microarranjo em 300 mililitros de BSA 1% em PBS com 0,5% de tween por uma hora à temperatura ambiente com agitação suave.

Lave as lâminas em PBS com 0,1% de tween três vezes durante três minutos. Coloque a lâmina em uma grade para lâminas e centrifugue a 1.200 ×g por dois minutos para secar a lâmina de microarranjo. Para separar cada subarranjo, uma grade de cera é impressa sobre a lâmina.

Após pré-aquecer o carimbador de cera a 70 graus Celsius por cinco minutos, carregue a lâmina de microarranjo bloqueada no carimbador de cera com o lado dos anticorpos voltado para a cera. Puxe suavemente o manípulo para imprimir a cera uniformemente sobre a lâmina. Este método pode ser usado para realizar ensaios de perfilagem glicânica para uma única amostra ou para medir um único epítopo glicano em múltiplas amostras.

Aqui demonstraremos ensaios de perfilagem glicânica. Comece diluindo 40 microlitros de soro em 360 microlitros de PBS contendo 0,1% de tween, 0,1% de bridge 35 e 100 microgramas por mililitro, cada um, de IgG de camundongo, rato, coelho, cabra e jumento. Esse volume é suficiente para aplicar seis microlitros da solução de soro diluída em cada subarranjo.

Aplique cuidadosamente seis microlitros da amostra diluída ou do controle a cada subarranjo da lâmina. Incube a lâmina em um cassete umidificado com toalhas de papel úmidas à temperatura ambiente por uma hora. Enxágue a lâmina com PBS contendo 0,1% de tween três vezes, durante três minutos cada.

Em seguida, seque a lâmina centrifugando-a a 1200 vezes G durante dois minutos. Prepare 20 microlitros das proteínas de ligação a glicanos biotiniladas a 10 miligramas por mililitro em PBS tween em um tubo microfuga de 0,8 mililitro mantido em gelo. Aplique seis microlitros das lectinas biotiniladas diluídas em cada subarranjo da lâmina e incube na caixa de lâminas umidificada com toalhas de papel úmidas à temperatura ambiente por uma hora.

Após lavar as lâminas com PBS contendo 0,1% de tween três vezes como antes, seque a lâmina centrifugando-a a 1200 × g em uma centrífuga durante dois minutos. Prepare 400 microlitros de neutrevidina DITE 5 49 marcada a 10 miligramas por mililitro em PBS com 0,1% de tween em um tubo microfuge de 0,8 mililitro sobre gelo. Use uma pipeta repetidora para aplicar seis microlitros de neutrevidina DITE 5 49 marcada em cada subarranjo e incube a lâmina no cassete de lâminas umedecido à temperatura ambiente por uma hora após a incubação.

Lave a lâmina com PBS 0,1% tween três vezes durante três minutos. Seque a lâmina centrifugando-a a 1200 ×g em uma centrífuga durante dois minutos. Analise a lâmina utilizando um escâner de microarranjo de fluorescência com resolução de 10 milímetros.

As configurações do laser e do PMT devem ser tão fortes quanto possível, garantindo ao mesmo tempo que nenhuma saturação seja observada. Abra a imagem no Array Pro 3.2. Configure o modelo de matriz de acordo com o mapa da matriz que mostra as localizações dos pontos de anticorpo.

Alinhe cuidadosamente cada círculo do molde no local correspondente da imagem e extraia a intensidade de cada ponto para um arquivo Excel para análise posterior. Um micromatriz de anticorpos contendo 48 submatrizes idênticas com 26 anticorpos contra 20 glicoproteínas séricas e biotina. A BSA foi projetada e produzida conforme descrito neste vídeo para examinar a importância do procedimento de bloqueio.

No análise do perfil de glicoproteínas, dois lâminas idênticas de microarranjo foram geradas. Uma delas não foi quimicamente bloqueada, enquanto na outra foi aplicada a amostra controle nas submatrizes das colunas um e três, e uma amostra de soro de HCC em pool foi aplicada nas submatrizes das colunas dois e quatro 22.

Lectinas biotiniladas específicas para diferentes glicanos foram então aplicadas em cada submatriz, conforme mostrado nestas imagens das submatrizes. As lectinas ligaram-se aos anticorpos de captura nas colunas controle, gerando um fundo alto que era indistinguível das colunas com soro nas micromatrizes não bloqueadas. No entanto, quando o mesmo experimento foi realizado em uma lâmina de micromatriz de anticorpos quimicamente bloqueada, não houve ou houve ligação muito baixa aos anticorpos de captura nas colunas controle e alta ligação ao antígeno nas colunas com soro.

Esses resultados demonstram que o procedimento de bloqueio químico é uma etapa crítica para a medição de glicanos em glicoproteínas capturadas por anticorpos. Ao seguir o protocolo, os perfis de glicosilação de 22 glicoproteínas no soro de HCC podem ser obtidos. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em oito horas, se executada corretamente. Anticorpos, quando modificados, podem perder suas afinidades por seus antígenos e outras propriedades.

Portanto, é importante ter isso em mente e usar vários anticorpos diferentes provenientes de diferentes fontes ao seguir este procedimento. Outras medidas, como a detecção da concentração de cada proteína utilizando o mesmo lâmina de micromatriz, podem ser realizadas para responder perguntas adicionais, como se a alteração da glicosilação é devida à mudança nos níveis de expressão proteica ou exclusivamente à alteração da glicosilação em cada proteína individual. Não se esqueça de que trabalhar com amostras de soro contendo patógenos pode ser extremamente perigoso, e precauções, como o uso de luvas de proteção, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.