Espaço-Temporal Manipulação de Atividade GTPase Pequeno em nível subcelular e em escala de tempo de segundos em células vivas

Este vídeo demonstra um método no qual a luz UV é utilizada para manipular a atividade de uma proteína na membrana plasmática. Para isso, as células são cotransfectadas com a proteína FRB ancorada na membrana e a proteína de interesse fundida à FKBP. Um derivado de rapamicina fotoconfinado é adicionado ao meio.

Em seguida, durante a microscopia em tempo real em células vivas, luz UV é aplicada a uma região específica da célula. O ligador entre a rapamicina e a biotina é clivado, liberando o dimerizador químico e seu subproduto; o dimerizador liberado difunde-se para dentro das células e induz a dimerização entre a proteína de interesse marcada com FKBP e a FRB ancorada na membrana plasmática na região irradiada. Na ausência de radiação UV, FKBP e FRB não se associam, não produzindo, portanto, nenhum efeito.

A análise dos dados revela o recrutamento altamente localizado da proteína de interesse fundida com FKBP, com base em seu efeito fisiológico. A vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como abordagens farmacológicas e genéticas, é a combinação de rapidez de ação, especificidade do alvo e resolução espacial. As implicações desta técnica estendem-se à terapia de câncer metastático, que é uma consequência da migração por células cancerígenas.

Portanto, a manipulação da atividade de fatores-chave de migração pode revelar seu mecanismo molecular preciso, o que é pré-requisito para seu tratamento e cura. O procedimento será demonstrado por Chris Paul Meyer, um estudante de pós-graduação, e Bob de Rose, um técnico do meu laboratório. Inicie este protocolo combinando os seguintes componentes em um tubo estéril de microcentrífuga: plasmídeo, DNA, FRB ligado à membrana marcado com fluorescência, FKBP, TIA um e água desionizada; adicione uma microlitro de algumas cópias do gene HD à mistura e vortex.

Incube o tubo à temperatura ambiente por 20 minutos. Durante a incubação, adicione 50 microlitros de poli-L-lisina a cada poço de uma câmara de vidro com oito poços e incube por um minuto para revestir a superfície; em seguida, aspire a solução e lave o centro de cada poço com 50 µL de água desionizada. Em seguida, a tripsina é aplicada em células NIH 3T3 com confluência de 80 a 85%.

Após as células se desprendem, adicione 10 mililitros de DMEM contendo 10%FBS, transfira 375 microlitros da suspensão para um tubo estéril de 15 mililitros e centrifugue a 1.500 ×g por três minutos. Após a centrifugação, remova cuidadosamente o meio. Adicione 750 microlitros de DMEM com 10%FVS e Resus.

Suspenda o pellet pipetando suavemente para cima e para baixo várias vezes. Por fim, adicione a suspensão celular à solução de transfeção e, com a ponta da pipeta, misture suavemente, adicionando 250 microlitros da suspensão de transfeção celular em cada poço da câmara. Deslize e incube-o.

37 graus Celsius por 15 a 18 horas. Para sintetizar a rapamicina encapsulada, aduto de biotina. Comece preparando uma solução estoque de um milimolar de CRB em DMSO em um tubo fuge estéril, em um tubo microcentrífugo separado de 1,5 mililitro dissolva um miligrama de avadon em 250 microlitros de PBS.

Em seguida, conjugue a porção fotoativável à rapamicina. Adicione 0,5 microlitros da solução estoque de CRB à AVID dissolvida, misturando por inversão várias vezes e, em seguida, incube à temperatura ambiente por 15 minutos. Para obter a solução conjugada de CRB-AVID, exclua as moléculas pequenas não ligadas e purifique o CRBA equilibrando uma coluna de exclusão por tamanho G-25 com 300 microlitros de PBS.

Repita cinco vezes após a coluna ter sido equilibrada. Aplique 125 microlitros da solução de CRBA no centro da coluna. Em seguida, centrifugue a solução por dois minutos a 800 G, à temperatura ambiente, e colete o fluxo retido em um tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro após a transfeção das células.

Troque o meio por DMEM sem FBS para privar as células de soro e incube por 12 horas. Após a incubação, aspire cuidadosamente o meio e adicione 250 microlitros da solução de CRBA preparada a um micromolar. Em seguida, para visualizar a dinâmica proteica em células vivas, utilize um microscópio confocal de disco giratório com iluminação UV acoplado a óptica para luz LED UV a 365 nanômetros.

Com luz de fluorescência epi. Defina as coordenadas e o tamanho de um ponto de iluminação utilizando uma placa de vidro revestida com corantes fluorescentes excitados por luz UV. Isso permite o ajuste fino da área a ser irradiada.

Coloque a lâmina de câmara com as células na platina usando um objetivo de 100 x e fluorescência epipolar. Foque as células e localize uma célula. Para a aquisição de imagens, inicie a captura após determinar os níveis de fundo do efeito fisiológico.

Aqui, a ondulação da membrana é medida irradiando luz UV em um quadrante escolhido da célula, liberando o composto aprisionado e, assim, o rapamicina original em DMSO e depois em PBS até uma concentração final de 400 nanomolar. Adicione 100 microlitros da solução à câmara de imagem para induzir efeitos globais. Capture imagens de fluorescência a cada 15 segundos durante 20 minutos para determinar se a ativação localizada de RAC pode induzir a formação local de pregas.

Células NIH 3T3 foram transfectadas com o ativador de RAC marcado com YFP, FK bp, TIA um e LDR, que é uma proteína ancorada na membrana. A irradiação FRB localizada na borda da célula, indicada pelo círculo amarelo, foi seguida por iluminação global com uma lâmpada de mercúrio durante um segundo, iniciando aos 1063 segundos. Como pode ser observado aqui, quase não houve ondulação da membrana no início.

No entanto, após iluminação localizada, observou-se ondulação espacialmente confinada após a iluminação global e adição de rapamicina, o que provoca a translocação de FK bp TIA um para a membrana plasmática. A célula exibiu formação global de ondulações, indicando que a formação de ondulações localmente observada anteriormente foi causada pela ativação espacialmente confinada de rack. Para uma análise quantitativa, células-alvo foram divididas em quatro quadrantes e a frequência de formação de ondulações em cada quadrante após estimulação local, bem como após estimulação global, foi determinada, conforme mostrado neste gráfico.

Nenhuma das células observadas apresentou formação de rufos com CRBA sem irradiação UV ou com UV local, com ou sem Aden no meio em volume. No entanto, quando o CRBA foi adicionado e realizada a irradiação UV, a formação de rufos foi observada em aproximadamente a mesma frequência, cerca de 90% em todos os quadrantes com irradiação global; quando apenas o quadrante um foi irradiado, a frequência de formação de rufos foi de 100% em comparação com 30%, 25% e 30% nos quadrantes dois a quatro. Esses resultados indicam que o desbloqueio localizado da rapamicina pode ser usado para induzir efeitos fisiológicos altamente localizados em uma única célula.

Neste caso, o enrugamento da membrana é causado pela ativação da rack. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como obter controle espacial e temporal da atividade de TPAs pequenas mediada por luz. Este método pode ser aplicado a qualquer processo fisiológico que dependa da translocação específica de proteínas para a membrana plasmática.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de preparar recentemente soluções, reagentes e células para cada procedimento. Não se esqueça de que trabalhar com luz UV pode ser extremamente perigoso e precauções, como o uso de óculos de proteção contra UV, devem sempre ser adotadas.