Microscopia de fluorescência de Triagem e seqüenciamento da próxima geração: Ferramentas úteis para a identificação de genes envolvidos na integridade das Organelas

O objetivo deste experimento é identificar o gene ou os genes responsáveis pela integridade morfológica e funcional de organelas vegetais. Isso é realizado primeiramente adicionando etil metanosulfonato como agente químico para induzir mutagênese em sementes atópicas portadoras do marcador fluorescente de organelas. O segundo passo consiste em coletar sementes de plantas individuais da primeira geração mutagênica para cultivar linhagens da geração mutante subsequente M2.

Em seguida, as sementes mutagênicas de Eliana são observadas usando um microscópio confocal ou fluorescente para identificar o fenótipo aberrante dos órgãos. O passo final é gerar a terceira geração mutagênica e confirmar a presença do fenótipo mutante. Em última instância, a mutação recessiva pode ser mapeada utilizando ferramentas de sequenciamento de nova geração.

Uma vez identificada a localização do gene mutante, a transformação com o gene selvagem deve restaurar o fenótipo organelar aberrante. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais sobre a manutenção da integridade morfológica e funcional das organelas vegetais. O tratamento de sementes de atop sta com metanosulfonato de atil induz alterações de timina em citosina no genoma, resultando em mudança de citosina para guanina em timina.

Adição de mutações. O tratamento com EMS é uma etapa fundamental deste protocolo para garantir uma proporção perfeita de mutações em indivíduos M2. Para iniciar, obtenha sementes de Arabidopsis do tipo selvagem Columbia Ecótipo que tenham sido previamente modificadas para carregar um marcador fluorescente de organela relevante.

Transfira 0,8 gramas ou cerca de 40.000 sementes para um tubo cônico de 50 mililitros. Em seguida, adicione 25 mililitros de água destilada e 0,2% de metano sulfonato de etila. Incube a mistura por 16 horas em um agitador de mutagênese em velocidade baixa. Após a incubação, aspire o líquido e descarte-o em um frasco contendo hidróxido de sódio 1 molar.

Para inativar o EMS, adicione 25 mililitros de água ao tubo Falcon contendo as sementes. Feche o tubo e inverta cinco vezes para lavar as sementes. Após todas as sementes sedimentarem, aspire a água e descarte no frasco contendo hidróxido de sódio um molar.

Repita este passo de lavagem até 10 vezes após a lavagem final, deixando as sementes em uma quantidade mínima de água. Prossiga para a esterilização das sementes adicionando 25 mililitros de hipoclorito a 10% e agitando vigorosamente por 30 segundos. Assim que as sementes sedimentarem no fundo, descarte o hipoclorito e enxágue com 25 mililitros de água estéril.

Após a remoção da água estéril, adicione 25 mililitros de etanol 70%. Agite os tubos por 30 segundos e deixe as sementes sedimentarem no fundo. Descarte o etanol e lave com 25 mililitros de água estéril.

Repita a lavagem com água estéril duas vezes. Em seguida, despeje as sementes em uma placa de Petri de plástico contendo papel de filtro de três mm. Deixe as sementes secarem sob a capela após incubá-las por dois dias a quatro graus Celsius.

Coloque as sementes em uma placa de Petri de 150 milímetros com aproximadamente 250 a 300 sementes por placa, em meio meio Magi e Scoog contendo fighter gel. Como agente de solidificação, cultive as sementes da geração M1 em placas por duas semanas. Transplante as plântulas para o solo e permita que as plantas continuem a crescer.

Após 30 a 45 dias, as plantas atingirão o estágio maduro, no qual sementes maduras podem ser claramente observadas. Nesse momento, colete duas sementes de cada planta M1 para gerar 1.000 linhagens independentes M2. Para observar as plântulas com microscópio confocal ou de fluorescência, cultive 60 sementes de cada linhagem M2 por sete a 10 dias em placas de Petri plásticas pela metade.

Em meio Moreish e scoog contendo gel de fighter, cultive também cinco plântulas do controle não tratado com EMS no mesmo meio. Após o crescimento das plântulas, monte cinco a 10 preparações com as extremidades das raízes com o lado do selo ABAC voltado para a objetiva de 40 vezes em uma lâmina de microscópio e, sob fluorescência, examine cada oleína desde a região cortical até a mediana em busca de alterações na distribuição subcelular do marcador de organela. Após o transplante das plantas positivas para o solo e o cultivo das plântulas conforme descrito anteriormente, confirme que o fenótipo mutante está na geração M três.

Remova as mutações de fundo contaminantes por meio de cruzamentos retrogrados pelo menos três vezes com um genoma selvagem contendo o marcador fluorescente organelar desejado, conforme descrito no protocolo escrito. Para iniciar o mapeamento, utilize o kit cogen DN Easy Z plant mini para extrair aproximadamente três microgramas de DNA genômico de M três, que representa o DNA mutante homozigoto de Columbia. Envie este DNA para sequenciamento no analisador genômico Illumina two 14.

A próxima etapa consiste em cruzar o mutante zago da Colômbia com Las Berger para gerar a progênie única após autopolinização, na qual a combinação pode ocorrer. A geração homozigota resultante servirá, em última instância, como uma população de mapeamento contendo o gene de interesse, que é o responsável pela mutação. Ao comparar o DNA genômico dessa população com o DNA genômico de plantas do tipo selvagem, a localização da mutação pode ser identificada no genoma.

Após o crescimento das plantas F dois, colete entre 70 e 100 indivíduos F dois que apresentem o fenótipo aberrante e o mesmo número de plantas F dois com fenótipo selvagem, coletando um disco foliar de cada planta utilizando um furador circular. O disco foliar deve ser coletado de folhas da mesma idade. Para garantir quantidades semelhantes de DNA, as amostras podem ser processadas para extração genômica separadamente ou em grupos.

Neste caso, é possível coletar de cinco a dez amostras para cada tubo eppendorf, de modo que haja menos tubos dos quais o DNA genômico precisa ser extraído. Utilize o kit de purificação de DNA de folha de planta Master Pure para extrair o DNA genômico. O DNA genômico obtido de cada amostra pode então ser quantificado com um NanoDrop.

Em seguida, combine quantidades iguais de DNA de cada amostra até um total de 300 nanogramas, mantendo as amostras mutantes e selvagens separadas para preparar primeiro a reação de marcação; adicione 60 microlitros de solução de iniciadores aleatórios 2,5 x e 42 microlitros de água. Após a desnaturação do DNA a mais de 95 graus Celsius por cinco a 10 minutos, resfrie as amostras em gelo para desnaturar o DNA. Adicione 15 microlitros de 10 X DNtps.

Misture com biotina DCTP e complete com três microlitros. Glen polimerase. Incube as amostras durante a noite a 25 graus Celsius.

No dia seguinte, adicione 15 microlitros de acetato de sódio três molar e 400 microlitros de etanol a 100% frio. Incube as amostras misturadas a menos 80 graus Celsius por uma hora após a centrifugação a 20.500 ×g por 15 minutos. Lave o pellet com 500 microlitros de etanol a 75% frio subsequente a uma segunda centrifugação.

Seque os pellets de DNA a 37 graus Celsius por 10 minutos. Re-suspenda os pellets em 100 microlitros de água e use cinco microlitros para verificar o rendimento e a qualidade em um gel bio. As reações de marcação com primers aleatórios foram carregadas em um gel de agarose 1%, provenientes de um pool de plantas F2 selvagens e de um pool de plantas F2 mutantes.

Como etapa final, envie 95 microlitros da reação de marcação do tipo selvagem e mutante para hibridização com o arranjo genômico do chip de arabidopsis ath1. Após a leitura pelo eraser, os arquivos CL pontilhados resultantes obtidos são analisados usando nosso software. Após instalar nosso software, abra o programa e cole a sequência bioconductor encontrada no procedimento escrito.

Em seguida, pressione a tecla Enter, o que instalará os pacotes padrão do BIOCONDUCTOR a partir do site de matrizes, genotipagem e mapeamento. Baixe e descompacte os arquivos listados no texto em uma nova pasta na área de trabalho. Mantenha os dados obtidos do experimento com o gene chip para o tipo selvagem C, L e o mutante C. Agora copie os dados do gene chip do tipo selvagem C e do mutante C para a pasta.

Em seguida, abra o R em um computador com Windows. Clique em arquivo e depois em alterar diretório. Selecione a pasta que contém os arquivos, clique em carregar espaço de trabalho do arquivo e então selecione A um V cinco R dados abrir ler C fazer R usando o bloco de notas e copie todo o texto para o R em um Mac, clique em mis e depois em alterar diretório de trabalho.

Selecione a pasta que contém os arquivos. Clique em workspace load workspace file e selecione o arquivo de dados ATH one V five R. Da mesma forma, abra ambos SFP R e MAP R usando o editor de texto, copie o texto e cole no R na janela do console.

Uma mensagem aparecerá para pesquisar genes na Recurso de Informação sobre Arabidopsis ou TAIR. Copie e cole o link encontrado no texto no navegador da internet. Uma janela aparecerá e solicitará abrir ou salvar o arquivo.

Selecione salvar. Escolha um nome de arquivo e anexe a extensão. Faça x ls.

Em seguida, clique em salvar. É mostrado aqui um resultado típico esperado. Após analisar os dados obtidos do chip genético Arabidopsis H um arranjo genômico, esta figura representa um exemplo de mapeamento da mutação Columbia zero utilizando o chip genético Arabidopsis, uma hibridização genômica H um, em que as barras horizontais representam os limiares de detecção.

A mutação neste exemplo está localizada no cromossomo um, delimitada por barras verticais. Abra o arquivo dot XLS para encontrar a coordenada do mutante dentro da região mapeada. Nas leituras montadas do genoma do mutante, identifique transições específicas de EMS entre os polimorfismos de nucleotídeo único.

Uma vez dominada a abordagem, o método descrito neste protocolo pode ser usado para mapear genes em um período de tempo bastante curto, em comparação com o método clássico de mapeamento.