Usando RNA mediada estratégia de alimentação Interferência em tela para genes envolvidos na regulação do tamanho corporal na Nemátodo
13 de fevereiro de 2013
Nós demonstramos como usar a técnica de alimentação RNAi para derrubar genes-alvo e pontuação fenótipo tamanho do corpo C. elegans. Este método poderia ser utilizado para um ecrã de grande escala para identificar potenciais componentes genéticos de interesse, tais como aqueles que estão envolvidos na regulação do tamanho do corpo por sinalização DBL-1/TGF-β.
Este vídeo demonstra um procedimento para identificar genes que regulam o crescimento e o tamanho corporal. Utilizando interferência de RNA ou RNAi para inativar genes candidatos, primeiramente são preparados placas contendo bactérias que expressam RNA de fita dupla, que tem como alvo os genes de interesse. Hermáfragas no quarto estágio larval são transferidas para as placas de RNAi.
Uma vez que atingem o estágio de adulto jovem, são transferidos para novas placas de RNAi para pôr ovos. Após várias horas, são removidos, deixando populações sincronizadas de embriões. No estágio desejado de desenvolvimento, a prole é coletada e montada em lâminas.
Finalmente, são adquiridas imagens microscópicas dos vermes. A análise da imagem demonstra alterações no tamanho corporal provocadas pela inativação gênica. Embora este método possa ser usado para identificar reguladores da via de sinalização TGF beta, ele também pode ser aplicado a outras vias que regulam o desenvolvimento pós-embrionário em *C. elegans*, como a via de sinalização da insulina.
Inicie este procedimento clonando as sequências do gene alvo no vetor L 4 4 4 0 A, um plasmídeo de RNAi comumente usado em vermes; transforme o plasmídeo recombinante na linhagem bacteriana HT one 15 DE three. Incube as bactérias transformadas em placas de ágar LB contendo 25 microgramas por mililitro de carbonic e 12,5 microgramas por mililitro de tetraciclina, em seguida escolha uma única colônia para uso futuro.
Enquanto isso, transforme o vetor vazio L 4 4 4 0 na linhagem bacteriana HT one 15. Para utilizar como controle para o cultivo dos experimentos, incube as bactérias transformadas em um mililitro de caldo LB com 100 microgramas por mililitro de ampicilina durante a noite a 37 graus Celsius.
A tetraciclina não é adicionada porque reduz a eficiência do RNAI. Adicione outros cinco mililitros de caldo LB com 100 microgramas por mililitro de ampicilina ao cultivo noturno e, em seguida, incube por mais quatro a seis horas a 37 graus Celsius. Quando o cultivo estiver pronto, plaque 0,5 mililitro de bactérias experimentais ou controle nas placas de vermes com RNAI, identificadas com o nome apropriado do clone.
Devem ser preparadas pelo menos duas placas para cada condição. Incube as placas durante a noite a 37 graus Celsius. No dia seguinte.
Uma camada uniforme de bactérias deve estar presente, expressando RNAi com ou sem a sequência do gene alvo. Os animais utilizarão as bactérias como fonte alimentar. Assim que as placas de alimentação com RNAi estiverem prontas, esterilize a ponta de um fio de platina com chama.
Em seguida, use o fio de platina para transferir de seis a dez larvas em estágio L4 ou L quatro C. elegans hermafroditas para cada placa de RNAi. Incube os hermafroditas a 20 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, os animais estarão em estágio de adultos jovens.
Transfira-os para uma nova placa RNAi apropriadamente rotulada e preparada. Incube as placas a 20 graus Celsius por quatro a seis horas para permitir que os adultos depositem ovos. Após a incubação, remova todos os adultos da placa para sincronizar a prole.
Uma vez removidos os adultos, comece a contar o tempo. Este é o tempo zero. Incube as placas a 20 graus Celsius para permitir que os animais cresçam até a fase de desenvolvimento de interesse.
Aqui, adultos jovens serão escolhidos para análise fenotípica. Para os animais com redução da expressão gênica que se desenvolvem em ritmo normal, é necessário um período de incubação de 72 horas. Tenha em mente que diversos genes afetam o desenvolvimento do animal de maneira distinta, portanto os tempos de incubação podem precisar ser ajustados.
Se o RNAi causar aos animais um crescimento em uma taxa diferente, adultos jovens podem ser identificados como aqueles com no máximo 24 horas após o L4, com desenvolvimento VUL completo e dois a seis embriões no útero, conforme mostrado aqui. Para identificar outros estágios de desenvolvimento, o pesquisador deve usar o desenvolvimento gonadal e VUL como guia. Uma vez que os animais tenham crescido até o estágio apropriado, prepare-se para avaliar os fenótipos de tamanho corporal dos vermes tratados com RNAi.
Em seguida, coloque duas camadas de fita adesiva colorida em uma lâmina de vidro com espessura de um milímetro, conforme mostrado aqui. Prepare duas dessas lâminas de vidro. Depois, posicione uma lâmina de vidro nova entre as duas lâminas com a fita e aplique uma gota de Agros 2% fundido em água.
No centro da nova lâmina de vidro, pressione uma segunda lâmina de vidro por cima para formar uma almofada fina de agarose. Uma vez que a agarose tenha solidificado, remova a lâmina superior. A lâmina com a almofada de agarose está pronta para receber os vermes.
Rotule a lâmina com o nome do clone. Adicione 10 microlitros de azida de sódio 25 milimolar ao suporte aros. Em seguida, usando um fio de platina como antes, transfira 30 a 40 animais para a solução de azida de sódio.
Para imobilizá-los, coloque uma lamínula por cima. Faça isso tanto para os animais recombinantes quanto para os L 4 4 4 0 vazios portadores de RNAi tratados. Em seguida, posicione a lâmina micrométrica sob o microscópio estereoscópico com uma lente objetiva de 2,5 x.
Usando o software Q Capture ou outro similar, capture uma imagem da régua micrométrica e salve-a. Em seguida, coloque os vermes sob o microscópio e capture as imagens. Para medir primeiro o comprimento do corpo, abra a imagem da régua micrométrica no software Image Pro.
Em seguida, clique em medir e escolha calibração. Depois, selecione o assistente de calibração espacial com a opção calibrar a imagem ativa selecionada. Clique em próximo.
Digite o nome para a calibração e certifique-se de que as unidades de referência espacial estejam definidas em mícrons. Em seguida, marque a caixa Criar uma calibração de referência e clique em Avançar. Clique em desenhar linha de referência.
Uma barra de escala de referência aparecerá. Reposicione a barra de escala para alinhá-la às extremidades do micrômetro. Em seguida, indique que a referência corresponde a 1000 unidades.
Clique em OK. Depois e em concluir. Uma vez que o software estiver calibrado, abra uma imagem de um verme.
Em seguida, no menu medir, selecione calibração e depois clique em selecionar espacial. No menu suspenso, selecione o nome do arquivo criado para a calibração do micrômetro. Em seguida, no menu medir, selecione medições na janela que abrir.
Selecione a ferramenta de desenho livre e, utilizando o mouse do computador, trace uma linha pelo centro do corpo do animal, do cabeça ao rabo. O comprimento será exibido na janela. Repita este processo para todos os animais no campo.
Exporte as medidas de comprimento para um arquivo do Microsoft Excel ou outro software estatístico apropriado. Analise os dados calculando a média e o desvio padrão para cada amostra. Em seguida, compare os resultados de cada grupo utilizando um teste t de Student.
A proteína DBL um da superfamília do fator de crescimento transformador beta ou TGF beta é necessária para a ativação da via do TGF beta. Em resposta à ativação do sinal, os transdutores de sinal intracelulares smad translocam-se para o núcleo e iniciam a transcrição gênica. Ver elegância na qual a via do TGF beta é interrompida apresenta tamanho corporal menor, incluindo comprimento corporal mais curto do que animais do tipo selvagem.
Assim, telas para C. elegans são capazes de identificar componentes e modificadores da sinalização TGF beta e testar a eficácia do RNAi por alimentação para a identificação de mutantes de tamanho corporal. O RNAi foi usado para reduzir os componentes da via DBL-1, SMA-3 e SMA-6, em quatro linhagens diferentes de C. elegans.
As linhagens de C. elegans testadas incluíram duas com hipersensibilidade a RNAi: A um, Lin 15 B e RF três, bem como a linhagem selvagem padrão N dois e a linhagem LIN 36, cuja sensibilidade ao RNAi é semelhante à de N dois, conforme demonstrado aqui. Quando a expressão de SMA três ou SMA seis foi interrompida, os animais exibiram um tamanho corporal significativamente menor do que os animais controle, exceto no caso de RNAi para SMA seis em Lin 36. Fundo em RF três.
Os comprimentos corporais de adultos jovens após o tratamento com RNAi foram de 84 a 95% dos animais tratados apenas com vetor. Em um fundo genético Lin-15B, os comprimentos corporais de adultos jovens após RNAi foram de 68 a 86% dos animais controle. No entanto, a linhagem lin-15B produz pouca prole.
Isso as torna inadequadas para triagem em larga escala. Portanto, sugere-se o uso da linhagem RF de três cepas para essas técnicas. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como identificar genes que regulam o crescimento e o tamanho corporal utilizando a técnica de interferência por RNI.
Veja a transcrição completa e aceda a milhares de vídeos científicos
Visão geral
Este vídeo demonstra um procedimento para usar a interferência de RNA (RNAi) para identificar genes que regulam o crescimento e o tamanho corporal em C. elegans. O método permite a triagem em larga escala para descobrir componentes genéticos envolvidos na regulação do tamanho corporal através da sinalização DBL-1/TGF-β.
Componentes principais do estudo
Área da ciência
- Neurociência
- Genética
- Biologia do Desenvolvimento
Fundo
- C. elegans é um organismo modelo para estudar a regulação genética.
- A interferência de RNA é uma ferramenta poderosa para a redução gênica.
- A regulação do tamanho corporal é influenciada por vários fatores genéticos.
- A sinalização DBL-1/TGF-β desempenha um papel no crescimento e desenvolvimento.
Propósito do estudo
- Demonstrar a técnica de alimentação RNAi.
- Identificar genes que afetam o tamanho corporal em C. elegans.
- Facilitar a triagem genética em larga escala.
Métodos utilizados
- Preparação de placas RNAi com bactérias expressando RNA de fita dupla.
- Transferência de hermafroditas na quarta fase larval para placas RNAi.
- Coleta de populações sincronizadas de embriões após a postura dos ovos.
- Montagem da progênie em lâminas para observação.
Principais resultados
- Reducção bem-sucedida dos genes alvo usando RNAi.
- Observação de fenótipos de tamanho corporal em C. elegans.
- Identificação de potenciais componentes genéticos envolvidos na regulação do crescimento.
- Demonstração da eficácia do RNAi em um contexto de desenvolvimento.
Conclusões
- A técnica de alimentação RNAi é eficaz para a redução gênica em C. elegans.
- Este método pode ser utilizado para triagem genética em larga escala.
- Os resultados contribuem para a compreensão da regulação genética do tamanho corporal.
Perguntas frequentes
Executive Industry Relevance
This RNAi feeding strategy enables scalable, cost-effective screening for genes regulating body size in C. elegans, supporting target validation in developmental pathways. By linking phenotypic readouts to TGF-β signaling, it provides mechanistic de-risking for early discovery programs focused on growth regulation. The method’s reproducibility and minimal equipment needs make it suitable for academic-industrial collaboration in preclinical target identification.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by knocking down candidate genes to assess body size phenotypes.
- Operational Value: Uses RNAi hypersensitive strains like rrf-3 to enhance knockdown sensitivity and reduce false negatives.
- Predictive Value: Identifies TGF-β pathway components such as sma-3 and sma-6, supporting target confidence in growth regulation.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces synchronized worm populations for consistent developmental staging and phenotypic scoring.
- Quantitative Output: Enables body length measurement via microscopy and image analysis, generating continuous data for statistical comparison.
- Scalability: Compatible with multi-well formats and bacterial feeding systems for medium-throughput screening.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Aligns with conserved TGF-β signaling pathways implicated in fibrosis, oncology, and metabolic disorders.
- Translational Continuity: Supports progression from target hit to preclinical validation by confirming phenotypic impact in a whole-organism context.
- Risk-Adjusted Decisions: Enables go/no-go decisions based on body size penetrance and expressivity across genetic backgrounds.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to lead identification, where genetic hits are prioritized for pathway validation and mechanistic follow-up.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of gene function in body size regulation through loss-of-function phenotyping.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative body size readouts essential for assay standardization and hit confirmation.
- Analytics: Generates length measurements analyzed via mean, standard deviation, and Student’s T-test to evaluate statistical significance.
- Translational Research: Connects to preclinical work by validating hits in conserved pathways like TGF-β, which have mammalian orthologs.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable RNAi feeding platform applicable to other phenotypes such as motility, lifespan, or stress resistance.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by linking gene knockdown to defined phenotypic outcomes in a genetically tractable model.
- Operational Value: Standardizes worm handling, RNAi feeding, and imaging protocols across users and laboratories.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early-stage target triage using low-cost, high-information-content assays.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of targets based on phenotypic strength and pathway relevance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in C. elegans handling, RNAi techniques, and microscopic imaging.
- Depends on bacterial culture systems, RNAi plasmids, and temperature-controlled incubators.
- Necessitates standardization of worm staging, feeding duration, and phenotypic scoring across teams.
- Must account for variable RNAi efficiency across genetic backgrounds, as seen in lin-36 and rrf-3 strains.
- Limited to phenotypes observable in whole worms; not suitable for subcellular or biochemical readouts without adaptation.
