Análise de Frutas volátil Usando um Nariz Eletrônico

O objetivo geral deste procedimento é realizar uma análise rápida de compostos voláteis em frutas. Isso é realizado primeiramente cortando e homogeneizando o tecido da fruta. A seguir, a fase vapor acima da amostra líquida é analisada com o nariz eletrônico.

Após a análise com o nariz eletrônico, os dados são exportados e transformados. A etapa final do procedimento consiste em identificar as janelas de índice covas e consolidar os picos sob um único rótulo de índice covas utilizando a interface gráfica. Em última análise, os resultados mostram que as diferenças na abundância de folículos de frutas, medidas com um nariz eletrônico, podem ser relacionadas a tratamentos experimentais, como variedade da fruta, maturação e armazenamento.

A principal vantagem desta técnica em comparação com métodos existentes, como a cromatografia gasosa tradicional, é que ela permite uma análise mais rápida de compostos voláteis em frutas. Ao realizar esta análise, podem ocorrer pequenas alterações nos tempos de retenção dos analitos. Isso poderia levar à interpretação incorreta dos dados sem uma consideração cuidadosa do processo de alinhamento de picos.

Após a colheita dos frutos no estágio desejado de maturação, enxágue-os com água da torneira. Para remover sujeira e poeira, selecione os frutos para análise. Com base na ausência de defeitos externos e internos e no tamanho, corte frutos homogêneos longitudinalmente em gomos para serem utilizados na coleta de compostos voláteis.

Se aplicável, remova as sementes da casca, o tecido da cavidade das sementes ou frutos com caroço. A seleção do tecido deve ser consistente durante todo o experimento, e a variabilidade dentro de um único fruto deve ser considerada. Por exemplo, as amostras devem ser obtidas igualmente das regiões equatorial, da parte da flor e da parte da haste.

Combine o tecido de fruta selecionado, misture para randomizar e, em seguida, pese 200 gramas em um liquidificador comercial. Adicione 200 mililitros de solução saturada de cloreto de cálcio. O cloreto de cálcio tem a finalidade de atuar como inibidor da atividade enzimática, que pode ocorrer após o corte e a homogeneização da polpa da fruta.

Em seguida, adicione 50 microlitros de uma solução de 100 milimolar de dois metil butil isoato em metanol. Essa solução é adicionada como padrão interno para monitorar quaisquer perdas possíveis de compostos voláteis durante o processo de homogeneização. A seguir, homogeneíze a mistura em um liquidificador de laboratório por 30 segundos a 18.000 rpm.

Em seguida, despeje imediatamente em um frasco de vidro e feche com uma tampa de teflon. Mantenha o homogeneizado no frasco até que todas as amostras sejam preparadas. Pipete alíquotas de cinco mililitros de suco sem espuma em frascos âmbar de vidro de 20 mililitros, preparando pelo menos três frascos por amostra.

Para servir como réplicas técnicas. Feche os frascos com tampas metálicas rosqueadas equipadas com septos de silicone com teflon. Neste ponto, as amostras podem ser analisadas imediatamente ou congeladas rapidamente em nitrogênio líquido e armazenadas em temperatura ultra baixa para análise posterior.

Carregue o método de análise apropriado no Xenos. Insira os parâmetros conforme indicado no protocolo escrito. Conecte uma agulha de aço inoxidável com ponta não perfurante à entrada do Xenos.

Esvazie o sistema várias vezes com ar ambiente até que a linha de base esteja estável e não sejam detectados picos superiores a 200 contagens. Prepare-se para calibrar o instrumento inserindo uma agulha na septa de um frasco contendo uma solução de ácidos graxos de cadeia reta para aliviar a pressão. Em seguida, insira a agulha conectada à entrada do instrumento na septa.

Realize a calibração iniciando a amostragem do espaço superior. O resultado da calibração é utilizado pelo software do instrumento para converter o tempo de retenção dos picos referidos de unidades de tempo para unidades de índice de covas ou KI. Consequentemente, após o sistema ser calibrado, os tempos de retenção são informados em unidades KI.

Inicie a análise da amostra após a equilibrar por 30 minutos, inserindo as agulhas na septa do frasco da amostra. Como feito para a solução de ácidos graxos de cadeia linear. Inicie manualmente a amostragem do espaço livre clicando no botão de reprodução, o que ativa a bomba e retira os vapores presentes acima da amostra.

No final da análise, um cromatograma aparece na tela e o sensor é automaticamente aquecido a 150 graus Celsius por 10 segundos para limpeza. Quando a caixa de status do sistema ficar verde novamente, o instrumento estará pronto para analisar outra amostra. Para garantir uma linha de base estável e a correta limpeza do sistema, execute pelo menos um branco de ar entre cada amostra.

Analise pelo menos três réplicas técnicas por amostra, bem como brancos de frasco. Exporte os dados para um arquivo Microsoft Excel após a aquisição, utilizando a função de dados registrados no software Mense. Após a exportação dos dados, adicione colunas contendo rótulos para as variáveis e réplicas.

O formato de dados exportado do software do instrumento pode ser transformado para facilitar a manipulação, utilizando o script Python 0.6 gerado por este laboratório. O nome do arquivo de origem e o nome da planilha dos dados de entrada, bem como o nome desejado para o arquivo de saída, são editados diretamente no script. Esse script facilita a manipulação e análise dos dados por meio da identificação de kis únicos em todas as amostras.

Os dados são reorganizados com as informações das amostras nas linhas e os KIS únicos nas colunas, sendo que cada célula representa a área do pico correspondente. Se um pico não for detectado para um valor de KI em uma amostra, a célula correspondente permanece vazia. Em seguida, utilizando um segundo script gerado por esta importação de laboratório, os dados do arquivo editado na etapa anterior são importados.

A análise baseia-se na visualização e no exame do número de vezes que cada valor de KI foi detectado. Assim, o programa exibe um gráfico de barras com os acertos de KI. Para cada valor de KI, avalie os acertos de K em subconjuntos específicos de amostras, analisando cada grupo de réplicas técnicas em conjunto.

Para fazer isso, analise cada tratamento ou variável separadamente marcando ou desmarcando as caixas correspondentes. Após identificar a largura de cada janela de KI usando a interface gráfica, selecione aleatoriamente alguns dos cromatogramas correspondentes. No software mense, avalie picos sobrepostos entre as réplicas técnicas.

Uma vez que a janela de KI é individualizada, a função de mesclagem na interface gráfica é usada para mesclar os KIS que caem na janela no ki mais populoso primeiro. Clique no botão de mesclagem para ativar a função e selecione o ki mais populoso no centro da janela clicando com o botão esquerdo na barra correspondente. Após a seleção da barra, ela muda de cor e fica verde; para mesclar os KIS que estão dentro da janela no ki selecionado, clique com o botão direito nas barras correspondentes.

Isso faz com que as barras fiquem vermelhas enquanto uma barra azul de comprimento correspondente é adicionada sobre o ki central. Depois que todos os kis selecionados forem mesclados ao ki central apropriado, clique novamente no botão de mesclagem para aceitar as alterações. Isso faz com que o botão de mesclagem fique amarelo em caso de erros.

O botão de desagrupar também está disponível para desagrupar. Clique no botão de desagrupar na interface gráfica. Em seguida, clique com o botão direito sobre a barra vermelha a ser desagrupada.

Da cor vermelha, a barra fica azul. Clique novamente no botão desfazer mesclagem para aceitar as alterações. Se alguém tentar mesclar incorretamente dois picos em uma única amostra em um único valor de KI, uma mensagem de erro é exibida.

Após todas as operações de mesclagem terem sido salvas, salve o arquivo antes de prosseguir com a análise estatística; os cromatogramas dos brancos de ar e do frasco são analisados para monitorar possíveis contaminações. Uma vez identificados os ki dos picos e dos brancos, subtraia a área do pico detectado no branco de ar e/ou do frasco da área do pico presente na amostra. O nariz eletrônico foi capaz de detectar diferenças nos perfis voláteis entre frutos de melão colhidos em diferentes estágios de maturação.

Mostram-se aqui exemplos de cromatogramas de frutos jovens maduros e frutos totalmente maduros, revelando as diferenças na área dos picos. Para diversos picos, foram identificadas janelas de 20 K em todas as amostras. Uma análise de variantes mostrou que, entre essas diferentes kis, a abundância de 14 picos detectados pelo nariz eletrônico variou significativamente entre os dois estágios de maturação. Aqui, a abundância dos picos do fruto jovem maduro para cada uma dessas kis é representada em verde, e a do fruto totalmente maduro é representada em laranja.

Após a conclusão deste procedimento, outros métodos, como a cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas, podem ser realizados com o objetivo de identificar os componentes correspondentes a cada pico no nariz eletrônico após seu desenvolvimento. Esta técnica fornecerá uma ferramenta de análise rápida e permitirá que pesquisadores nas áreas de patologia vegetal, fisiologia vegetal, biologia pós-colheita e ciência dos alimentos explorem alterações na composição de compostos voláteis em frutas em função da maturação, variedade ou armazenamento. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como analisar rapidamente compostos voláteis com um nariz eletrônico e realizar o alinhamento de picos utilizando nossa interface gráfica.