Análise de Expressão Gênica Utilizando bacteriana Microarrays

Olá, meu nome é Ena e rotineiramente realizamos perfis de expressão gênica no laboratório. Utilizamos esta técnica para monitorar genes diferencialmente regulados entre metilação e tipo selvagem. Hoje, tenho amostras de RNA de tipo selvagem e metilado, e vamos fazer primeiro a etapa de C.

Utilizamos métodos de marcação indireta e a vantagem dessa técnica é evitar o viés visual que pode ocorrer na marcação direta. Para isso, temos amostras de RNA e optamos por obter três microgramas de RNA em um volume total de 13 microlitros. Em seguida, adicionamos 2,5 microlitros de hexâmeros aleatórios em nossas amostras.

E vamos incubar a amostra a 75 graus para desnaturar o RNA por oito minutos. Agora, vamos adicionar o coquetel de transcrição reversa que contém mistura contínua de AM L-D-L-D-U-T-P, tampão da transcriptase reversa e também ET TT Big, e incubar a amostra a 42 graus por quatro horas. Após quatro horas, basta retirar as amostras.

E agora no tubo temos uma mistura de cDNA e RNA. O que queremos fazer é hidrolisar o RNA adicionando hidróxido de sódio e EDTA, sendo que a concentração final de hidróxido de sódio deve ser cem molar. E a concentração final de EDTA deve ser cinco molar.

E agora vamos incubar as amostras em banho-maria a 65 graus por 10 minutos. A incubação está concluída e utilizaremos as amostras adicionando água pH 7,5 até a concentração final de 500 mols. Neste momento, você pode armazenar as amostras a -20 ou continuar com a etapa de purificação.

Para a purificação do cDNA, utilizamos o kit de purificação de PCR KaiGen. No entanto, como o tampão Bush e o tampão iônico contêm etanol, não os usamos; em vez disso, preparamos nosso próprio tampão Bush sem etanol e nosso próprio tampão iônico sem etanol, adicionamos 300 litros de PPI e pipetamos lentamente essa solução. Em seguida, transferimos a mistura para colunas e centrifugamos por um minuto na velocidade máxima. Depois, adicionamos 750 microlitros do tampão de lavagem fosfato que preparamos e, novamente, realizamos uma nova lavagem.

Então, vamos centrifugar novamente apenas para garantir que recuperamos todo o precipitado. E vamos transferir esses tubos para tubos receptores vazios. Vou adicionar 30 marcadores de tampão fosfato E, que é quatro molar de fosfato de potássio em pH 8,5.

E aqui você precisa apenas garantir que adicionou tudo ao centro da coluna e incubará à temperatura ambiente por um minuto. Então, girará novamente por um minuto e adicionarei mais 30 microlitros de tampão. Incubo em temperatura ambiente. Removo a coluna e temos um volume total de 60 microlitros ou CDA.

Uma vez que purifiquemos o cDNA, você pode armazená-lo a menos 20 graus, e também podemos secá-lo para armazenamento, então podemos secar o cDNA em feedback. Agora, no tubo, temos cDNA seco, que é uma modificação. E o que faremos é suspender a amostra seca em.

Vou suspender a amostra em 10 µL de bicarbonato de LAR 15 a pH 9. E farei isso apenas movimentando para cima e para baixo nesta etapa, pois é muito importante ressuspende o cDNA. Bem, para que a reação de incorporação funcione, essa reação deve ocorrer em ambiente escuro, porque os marcadores fluorescentes são sensíveis à luz.

No entanto, a escolha desses provenientes das ciências da vida é feita individualmente. O S5 tem tampa roxa e o lado 3 tem tampa laranja, e também o S5 aparece ciano quando está em suspensão, enquanto o Cary aparece magenta. Então, o que farei em uma sala escura é transferir essas amostras para tubos de corante, ressuspender o corante e transferi-los de volta para o tubo que tenho.

Em seguida, incubarei no escuro por duas horas; após essa incubação, interrompo a reação adicionando 35 µL de acetato de sódio 100 milimolar em pH 5,2. Depois disso, realizamos a purificação com um procedimento de limpeza semelhante. No entanto, desta vez utilizamos o tampão de lavagem e o tampão de eluição fornecidos pela Cajun.

Você pode descrever os locais onde colocou a amostra e isso deve limpar o instrumento. Então, você pode colocar sua amostra ou sua mistura agora mesmo. Aqui está minha amostra marcada com scifi e, aqui, o que observamos é a OD 260, que indica o teor de CDA, e a OD 650, que mostra a incorporação de D para o scifi. E aqui está minha amostra marcada com side three.

Novamente, torça seis concentrações e cinco medidas do local três de incorporação. Como minha corporação D trabalha eficientemente, combinarei as amostras agora. A senhorita a examinará brevemente. E agora escreveremos uma amostra novamente utilizando feedback.

Ok, então, para a reidratação da lâmina, vamos reidratá-la colocando universalmente a lâmina sobre água, o que fará com que as manchas aumentem de tamanho. E então, para proteger isso, vamos simplesmente secar rapidamente a 100 graus Celsius e, em seguida, hibridizar por UV ou realizar a ligação cruzada por UV das manchas na lâmina e, depois, incubaremos no tampão pré-hibridização que temos. Então, coloco a lâmina com a face voltada para baixo, mas ainda não a toco na água.

E vamos esperar assim por cinco minutos. Eu, como esta caixa parece maior, eles devem estar mais brilhantes do que antes de você colocar, e você simplesmente secará rapidamente colocando a lâmina a cem graus e observará a condensação. E nós faremos a reticulação junto com vocêi.

Para a hidratação, mergulharei simplesmente a lâmina em água pré-aquecida. E isso deve ser muito rápido, porque o objetivo aqui é eliminar todos os resíduos ou todos os oligos no ponto que não estão ligados. E se você for lento neste processo, acabará obtendo caudas de cometa nos seus pontos.

Então, certifique-se de fazer isso rapidamente e verifique se você não retira seu voo da água e faça este procedimento por 30 segundos e coloque imediatamente em temperatura ambiente por cinco minutos a 700 rpm. Pegue isso, coloque este lâmina no tampão da estação de pré-hibridização que tínhamos e empurre lentamente a lâmina para dentro do frasco e incubaremos a 42 graus por pelo menos 45 minutos. Aqui temos nossa amostra seca a ser hibridizada. Primeiro, re-suspenda em água.

Nesta etapa, basta ressuspender agitando para cima e para baixo, evitando expor excessivamente a amostra à luz branca. Em seguida, você adicionará 1,5 de DNA de esperma de salmão, com uma concentração de 10 miligramas por mililitro. E você adicionará 1,2 marcador de TRNA.

A concentração é de 12,5 miligramas por, adicionamos tRNA e DNA de esperma de salmão para bloquear a hibridização inespecífica. E adicionamos 5,35 marcador zero três XSSC, o que resulta em uma concentração final de três x. E, finalmente, adicionamos 3,5 microlitros de SDS a 1%.

Agora vamos ferver a mistura por cinco minutos e centrifugará à velocidade máxima por cinco minutos, e estará pronto para isso. Já se passou uma hora desde que incubamos nossa lâmina e agora tenho água e isopropanol. Então, vou agitar a lâmina na água primeiro para remover o SDS e depois lavar com dza propanol e colocar diretamente no calibre padrão.

E aqui, tenha cuidado para não expor muito a luz ao ar, para evitar secagem. Então, passo diretamente do tampão da estação de harmônio para a água e lavamos a lâmina. Alguns minutos, apenas certifique-se de que o movimento seja apenas para cima e para baixo, não lateralmente.

E também certifique-se de que a lâmina não esteja acima da água e vamos transferi-la imediatamente para isopropanol. E deixe-a aqui por alguns minutos novamente. E poderia deixar sua lâmina à temperatura ambiente por cinco minutos?

700 R.Cool. Portanto, nosso lâmina também está pronta para ser hibridizada e é melhor mantê-la em uma caixa de lâminas para protegê-la do transporte. Para a estação de colheita, usaremos elevação ou deslizamento.

Há tiras brancas na lamínula que fornecerão elevação e criarão espaço para a nossa amostra entre a lamínula e a lâmina. E eu a limpo com etanol e, em seguida, coloco o fio, certificando-me de que não haja partículas de teste. Primeiro, pegaremos nossa lâmina modelo, com a área de impressão marcada, e sobre ela colocaremos a lâmina que preparamos, certificando-nos de que estejam perfeitamente alinhadas.

Certifique-se de que eles estejam perfeitamente alinhados. E você precisa garantir que as tiras estejam no lado que vamos virar para baixo. Então é realmente difícil de ver, mas certifique-se de que você consiga enxergá-las.

E as listras devem estar nas laterais das lâminas. E vamos carregar nossa amostra pelas laterais. Eu uso pequenas quantidades de amostra, então tomo primeiro 15 microlitros e começo a carregar a partir do canto da lamínula.

E lentamente eu puxaria para dentro, movendo-me ao longo da borda para cobrir toda a área. Nesta etapa, é muito importante não introduzir bolhas, então pego outro migrador de 15 µL e aplico na lateral das lâminas para evitar qualquer secagem. Assim, nossa amostra está pronta e você incubará nossas lâminas em câmaras de priorização, que possuem microcanais para hidratar a lâmina durante a hibridização.

E adicionaremos 10 marcadores de três XSSC em seis cantos da lâmina. Havia seis locais na, na câmara, desculpe, em cada canto e em cada lado. Certifique-se de transferir a lâmina com muito cuidado para que a lamínula não escorregue. E quando você colocar a lâmina com o lado certo para cima, verá que ela se fixará na água que você colocou; posicione a lamínula e certifique-se de que os parafusos estão bem apertados.

Vamos incubar a câmara de reação em um banho-maria a 65 graus, mas não queremos colocá-la diretamente no fundo. Por isso, colocamos uma barreira de plástico para evitar a transferência excessiva de calor. Em seguida, posicionamos suavemente a nossa câmara de reação e, para evitar qualquer deslocamento, também pode-se colocar algum peso.

E essa incubação será realizada durante a noite, normalmente entre 10 a 12 horas. Para a lavagem do corte, utilizamos um XSSC com 0,05 por cento de SDS. Isso será usado para remover a lamínula.

E esta etapa será para a lavagem do primeiro passo. E realizaremos mais duas etapas apenas com 0,06% de six XSC em todo o SDS que temos. Então, finalizamos a conversa, pegamos as lâminas e as colocamos com a face voltada para baixo no recipiente.

E vamos apenas agitar suavemente de um lado para o outro e veremos que a lamínula se soltará com cuidado. Muito bem, e então vamos transferir para outro tampão de lavagem que contém XES. Incube por um minuto.

Transfira para o tubo oh seis XSSC. E apenas para garantir que eliminamos todo o FDS, repetiremos mais uma vez. Centrifugue até secar por cinco minutos à temperatura ambiente a 700 rpm. Mantenha este lâmina na caixa de lâminas porque é sensível à luz.

Este é o escâner de lâminas e você colocará a lâmina aqui, neste pequeno espaço, com a face voltada para baixo e o rótulo voltado para frente. Na segunda lâmina, você simplesmente definirá a área que deseja escanear. E você selecionará esta área em nossas lâminas. Temos, utilizamos 16 pinças para imprimir nossas lâminas.

Assim, cada bloco corresponde a um pino e nossas lâminas contêm mais de 8.000 pontos. E representamos o genoma do vi color duas vezes porque possui cerca de 4.000 genes. Portanto, temos dois pontos para cada oligo que utilizamos.

E se esses forem ampliados, você veria que, neste experimento específico, comparamos mutantes de reguladores da transcrição com o tipo selvagem, e o mutante seria marcado com scifi, que confere cor vermelha. E o tipo selvagem foi o site três, que confere cor verde. Assim, qualquer coisa que pareça vermelha, como esses pontos, indica que a abundância dos transcritos no mutante foi maior do que no tipo selvagem.

Portanto, eles aparecem vermelhos ou em tons de vermelho, e qualquer coisa que apareça verde indica que a abundância do transcrito era maior no tipo selvagem em comparação com o mutante. E qualquer ponto que apareça amarelo indica que aquele transcrito estava igualmente presente tanto no mutante quanto no tipo selvagem. Assim, quando são sobrepostos, eles aparecem amarelos como esses pontos.