Misturadores microfluídicos para Estudar o dobramento de proteínas

O objetivo geral deste procedimento é misturar rapidamente duas soluções para iniciar uma reação bioquímica na escala de tempo de microssegundos. Isso é realizado primeiramente fabricando um misturador microfluídico. O segundo passo é ligar um chip a um vidro de cobertura para selar os canais.

Em seguida, o chip é montado em um manifold que contém os reservatórios da solução. O passo final é obter imagens da solução mista utilizando microscopia de fluorescência confocal. Em última análise, a reação bioquímica é capturada na escala de tempo de microssegundos ao converter a distância ao longo do canal de saída em tempo.

A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a mistura por parada de fluxo, é que a mistura não é limitada pela turbulência e ocorre em poucos microssegundos. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no campo da dobragem de proteínas, como por exemplo: quando ocorre o colapso hidrofóbico? Demonstrará o procedimento ling woo, pós-doutoranda do meu laboratório, para iniciar a fabricação de chips microfluídicos de mistura.

Primeiro, limpe as pastilhas de silício com solução de piranha fresca, conforme descrito no protocolo escrito que acompanha este vídeo. Em seguida, utilize um forno de deposição química por vapor a baixa pressão para aplicar um revestimento de polissilício com aproximadamente um mícron de espessura para cada 10 mícrons de profundidade pretendida nos canais microfluídicos finais. Após tratamento adicional das pastilhas conforme descrito no texto, faça a aplicação por centrifugação de uma camada de 900 nanômetros de espessura de fotoresina Z 52 14, seguida de pré-assamento a 90 graus Celsius diretamente em uma placa aquecedora por um minuto ou em forno a 110 graus Celsius por 30 minutos.

Após alinhar uma máscara fotográfica, faça um contato duro e a vácuo expondo primeiro o fotoresiste à luz ultravioleta por vários segundos. Em seguida, desenvolva o padrão no fotoresiste conforme listado no protocolo escrito. Inspecione as características na pastilha com um microscópio e faça uma cura térmica a 115 graus Celsius diretamente sobre uma placa aquecedora por dois minutos.

Em seguida, submeta as pastilhas ao tratamento com plasma de oxigênio ou Asher por 2,5 minutos, com potência de RF de 100 watts. Utilizando um gravador reativo por íons profundo, grave a camada de polissílica até atingir completamente a sílica fundida abaixo. Remova o fotoresistente remanescente e trate a pastilha conforme orientado no texto.

Meça a profundidade da corrosão para garantir que ela atravesse completamente o revestimento de poli. Utilizando um gravador a plasma reativo profundo com capacidade de óxido, grave a sílica fundida até uma profundidade de aproximadamente 10 mícrons por mícron de espessura do revestimento de poli. Limpe a pastilha com o aparelho de cinzaseração por matriz durante quatro minutos, com potência de RF de 100 watts, e remova o polissilício com um gravador de fluoreto de xenônio antes de perfurar os orifícios na pastilha. Aplique por centrifugação uma nova camada de um mícron de resistência fotossensível para proteger os canais durante o manuseio subsequente.

Em seguida, monte a pastilha com a face ativa voltada para baixo sobre uma placa de vidro sacrificial usando Aqua Bond 55. Tendo o cuidado de manter o bonder livre de bolhas, utilize uma broca de ponta de diamante controlada por computador e com refrigeração, juntamente com a solução de limpeza micro 90. Isso evita que pequenos fragmentos de vidro aderem aos canais, o que poderia entupir o chip durante o uso.

Prossiga para perfurar furos de entrada e saída em cada chip. Enxágue a pastilha com água desionizada usando uma seringa para injetar água em cada furo. Em seguida, mergulhe em água com sabão por uma hora após a remoção da foto.

Resist e adesivo conforme descrito no texto. Enxágue a pastilha com água desionizada e água morna com sabão. Enxágue novamente cada orifício com uma seringa, evitando as estruturas gravadas após passar nitrogênio pela pastilha.

Continue a secar em estufa a vácuo ajustada a 120 graus Celsius. Inspecione os orifícios para garantir que estejam livres de partículas abrasivas e repita os passos de limpeza conforme necessário. Os seguintes passos devem ser realizados na sala limpa.

Meça a profundidade dos canais com um perfilador de superfície óptico ou mecânico. Limpe a pastilha e um vidro de cobertura de sílica fundida conforme descrito no texto em uma sala limpa. Seque bem a pastilha com gás nitrogênio por pelo menos cinco minutos.

Em seguida, posicione a pastilha com a face funcional voltada para cima sobre uma pilha de três a quatro panos de limpeza de sala limpa colocados sobre uma superfície plana e rígida, como uma pequena placa de vidro. Repita o procedimento com o vidro de cobertura. Segure o vidro de cobertura pela borda e vire-o de modo que a face polida fique voltada para baixo sobre a pastilha.

Alinhe cuidadosamente as bordas planas, solte o lamínula sobre a pastilha e permita que ela assente; apenas empurre horizontalmente para ajustar o alinhamento. Pressione para baixo com um dedo no centro da pastilha. Deve-se observar um frente de ligação começando a se propagar para fora.

Se necessário, aplique pressão adicional em outras posições ao redor da pastilha para promover a propagação da frente de ligação. Após colocar as pastilhas seladas em uma estufa de alta temperatura programada com o perfil de temperatura indicado no texto, corte a pastilha com uma serra de corte de pastilhas em chips individuais. O manifold para segurar o chip de mistura e as soluções pode ser fabricado em plástico, como lexan ou plexiglass, ou em alumínio.

Para controle de temperatura, fixe o chip ao manifold usando pequenas o-rings e segure no lugar com um anel de retenção que permita uma visão óptica clara do centro do chip. Os sulcos para as o-rings devem ser mais rasos que o padrão para garantir um bom encaixe sem aplicar pressão excessiva sobre o chip. Após o chip ser montado, adicione soluções aos reservatórios central e laterais, tomando cuidado para liberar quaisquer bolhas aprisionadas na parte inferior dos poços.

Coloque o manifold em um microscópio invertido e examine a região de mistura pela ocular ou pela saída da câmera. Uma lanterna incandescente colocada sobre o manifold fornecerá luz suficiente. Utilize um corante ou solução de alto índice de refração no canal central para visualizar o jato.

Como os volumes utilizados neste misturador são tão pequenos, o fluxo pode ser controlado com pressão de ar aplicada acima dos poços da solução. Para visualizar o jato, comece com a pressão do canal lateral em zero libras por polegada quadrada e aumente lentamente até igualar à pressão do canal central. Se um dos canais laterais estiver entupido, o jato será empurrado contra uma das paredes do canal de saída.

Se aparecer uma obstrução visível, ela pode ser removida aplicando pressão ou vácuo ao canal de saída com uma seringa. Se a proteína ou outro material orgânico obstruir o chip, ele pode ser limpo mediante imersão em solução piranha durante a noite. Introduza um feixe de laser revestido em um microscópio de pesquisa utilizando um espelho dicróico interno ou logo fora do microscópio.

Alinhe o laser para que o foco possa ser visto na ocular ou câmera aproximadamente próximo à região de mistura. A fluorescência da proteína no misturador é coletada pela objetiva e enviada através do espelho dicróico, focalizada por uma lente até um orifício de pino e projetada em um contador de fótons. Varra o chip utilizando um scanner piezoelétrico em x e y para obter a imagem da região de mistura.

Escolha uma posição no jato e faça uma varredura em X e Y para encontrar o foco no centro do canal na direção vertical. A profundidade de campo do microscópio é muito menor que a profundidade do canal, e a taxa de fluxo é uniforme no interior do canal, exceto dentro de um mícron das paredes. Portanto, a resolução temporal da fluorescência observada é determinada principalmente pelo tamanho do ponto confocal.

Varra horizontalmente dentro do canal de saída em incrementos de 100 micrômetros ao longo do jato, observando por aproximadamente um milissegundo por posição. Mova o estágio do microscópio entre 80 e 90 micrômetros ao longo do jato para capturar tempos posteriores. Alternativamente, a luz pode ser detectada por um espectrógrafo e CCD após o espelho dicróico, utilizando uma lente para focalizar a luz na fenda de entrada.

Como a coleta de dados é mais lenta do que no caso do contador de fótons, normalmente o jato é primeiro imageado com o contador de fótons e, em seguida, pontos ao longo do jato são medidos com o espectrógrafo. Os dados do contador de fótons são analisados somando-se três a cinco pixels ao redor do jato em cada posição, criando-se um gráfico de intensidade versus distância. O tempo é calculado a partir da distância, utilizando-se uma velocidade calculada com base nas pressões aplicadas.

Como etapa final, analise os dados do espectrógrafo utilizando um dos métodos descritos no texto. Aqui é mostrado um gráfico de contorno da intensidade na região de mistura medida pelo contador de fótons. O fundo no canal de saída fora do jato deve estar próximo ao nível de ruído do detector e normalmente não é subtraído.

Um fundo mais alto pode indicar má alinhamento ou que a proteína está aderindo às paredes do canal. Por outro lado, um jato com aparência entortado ou irregular, especialmente próximo à região de mistura, indica uma gravação inadequada das ponteiras. Um espectro resolvido no tempo é mostrado para a proteína ACell coenzyme a binding protein ou A CBP marcada com Alexa 4 88 e Alexa 6 47.

Os retângulos verde e vermelho indicam os comprimentos de onda designados como canais doador e aceitador, respectivamente. Esses dados tiveram o fundo subtraído para remover a carga escura e o sinal do laser. O sinal de fundo foi obtido com a pressão do canal central ajustada para zero libras por polegada quadrada.

O tempo de mistura pode ser medido por meio da análise de uma reação rápida que seja muito mais rápida do que a mistura, como o rebaixamento da fluorescência de triptofano pelo iodeto de potássio. Como o jato é menor do que a resolução óptica do microscópio, ocorre uma grande queda na intensidade na região de mistura. À medida que o jato se forma, essa resposta do instrumento pode ser removida realizando-se uma medição controle na qual não há alteração nas condições da solução.

A razão entre experimentos de mistura e não mistura da fluorescência do amido de N-acetil triptofano é exibida nesta figura. A linha mostra a concentração prevista de iodeto de potássio a partir de modelagem e simulações multiphysics de console. O tempo de mistura, medido como o tempo necessário para a concentração diminuir 80%, é de oito microssegundos.

Este gráfico mostra as alterações no fret da proteína A CBP após a diluição do desnaturante de seis molares para 0,06 molares. Estes dados não requerem um experimento controle. Como o fret já é uma razão e a resposta do instrumento já foi removida, o salto rápido próximo a T igual a zero representa uma mudança rápida no sinal de fret dentro do tempo de mistura.

Após esse desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de dobramento de proteínas explorarem as etapas iniciais na formação da estrutura proteica.