Analisando internalização celular de nanopartículas e bactérias multi-espectral por Citometria de Fluxo Imagem

Para analisar os mecanismos celulares de internalização de nanopartículas e bactérias por citometria de fluxo com imagem multiespectral. Primeiramente, os macrófagos são pré-tratados com citocalasina D para inibir a polimerização da actina. Nanopartículas ou salmonela são adicionadas ao macrófago em monocamada e incubadas.

Em seguida, os macrófagos são colhidos, fixados e marcados para análise utilizando um sistema de imagem em fluxo. Células de citômetro de fluxo de imagem multiespectral que internalizaram nanopartículas e/ou salmonela são diferenciadas daquelas com nanopartículas e/ou salmonela ligadas à superfície. Os dados resultantes indicam que tanto a salmonela quanto as nanopartículas são internalizadas apenas por células que não foram tratadas com citocalasina.

D sugerindo que a internalização é dependente de actina. Esta técnica apresenta diversas vantagens em comparação com métodos existentes, como citometria de fluxo e microscopia confocal. Principalmente, ela fornece uma medida precisa das intensidades do sinal fluorescente e resolução espacial entre diferentes características celulares em alta velocidade.

Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais tanto na pesquisa de biomateriais para vacinas e entrega de fármacos, quanto em estudos sobre interações entre patógenos e hospedeiros. Isso inclui delimitar as vias de internalização utilizadas por nanopartículas de polianidrido e bactérias. Geralmente, indivíduos novos neste método enfrentam dificuldades.

É importante dedicar tempo à titulação dos corantes para obter sinais de fluorescência ideais. Além disso, é necessário tempo para se familiarizar com o software e criar modelos de análise. Tivemos a ideia inicial deste método quando descobrimos que nanopartículas polihidroxiladas exibem características que imitam patógenos ao utilizarmos microscopia e outras técnicas.

Em seguida, desejávamos um sistema de alto rendimento para comparar os processos de internalização utilizados pela salmonela e pelas nanopartículas de hidreto de polen antes de realizar o ensaio. Todas as culturas celulares de mamíferos e bacterianas devem ser colhidas e as suspensões de nanopartículas devem ser preparadas. Comece colhendo células RA W2 64.7 confluentes utilizando um raspador celular.

Determine o número de células utilizando um hemocitômetro. Em seguida, plaque as células em uma placa de cultura de 24 poços com uma densidade de cinco vezes 10 elevado à quinta células por poço em 0,5 mililitros. Complete com DMEM e incube durante a noite a 37 graus Celsius em uma incubadora com 5% de CO₂.

Para preparar a diluição de Salmonella typhimurium, transforme Salmonella em C-D-M-E-M para obter uma multiplicidade de infecção de cem por células RAW 264,7 em um tubo de cultura de vidro com tampa de rosca de 16 por 125 milímetros. Em seguida, utilizando papel manteiga esterilizado, pese cinco miligramas de nanopartículas de polianidrido carregadas com 1% de FITC, geradas conforme descrito por Rean e colegas em sua publicação de 2009 na Pharmaceutical Research, em um tubo microcentrífuga de 1,5 mililitro. Adicione as nanopartículas a 0,5 mililitros de solução salina tamponada com fosfato fria e coloque no gelo.

Mantendo o tubo em gelo. Use um processador ultrassônico com ponteira micro para sonificar a suspensão por aproximadamente 25 segundos a quatro a seis joules. Agora que todas as células e reagentes necessários estão prontos, o ensaio de fagocitose pode ser realizado.

Rotule placas de cultura tecidual de 24 poços contendo células RA W2 64.7 cultivadas em preparação para o ensaio na primeira placa. Cada uma das seguintes amostras será analisada em triplicata: citocalasina D com nanopartículas, citocalasina D com salmonela, meio com nanopartículas, meio com nanopartículas de salmonela, apenas salmonela e células coradas com AF6460 apenas. Os controles a quatro graus Celsius serão analisados na segunda placa e incluirão meio mais nanopartículas e meio mais salmonela, incubados nesta baixa temperatura para retardar processos celulares como fagocitose. Uma hora antes da indução, adicione cinco microgramas por mililitro de citocalasina D e C-D-M-E-M aos poços apropriados e incube as células a 37 graus Celsius.

Após a incubação, vortexe a suspensão de nanopartículas e adicione 10 microlitros às placas apropriadas. Em seguida, vortexe a salmonela e adicione-a às placas apropriadas com uma MOI de 100. Bata levemente na placa algumas vezes para misturar.

Em seguida, coloque as placas de amostra a 37 graus Celsius e as placas de controle negativo a quatro graus Celsius por 45 minutos. Após a incubação, coloque as placas sobre gelo, lave as células duas vezes com PBS gelado sem cálcio e magnésio por aspiração e descarte do meio antigo para remover partículas não ligadas, salmonela e células mortas ou destacadas. Uso de petal magnésio.

A pré-lavagem com PBS nesta etapa é essencial porque facilita a liberação das células do substrato. Para colher as células, adicione 250 microlitros de PBS gelado e desprenda suavemente as células dos poços, pipeteie as células colhidas para tubos de microcentrífuga com tampa de encaixe siliconizada e mantenha-os no gelo. Lave as células adicionando um mililitro de tampão de lavagem frio, em seguida centrifugue a 250 × g durante 10 minutos a quatro graus Celsius. Após descartar o sobrenadante, remova o tampão residual batendo suavemente o tubo de microcentrífuga invertido sobre papel absorvente.

Resuspenda o pellet celular movendo suavemente o tubo de microcentrífuga sobre um suporte para tubos de ensaio. Para fixar as células, adicione 100 microlitros de paraformaldeído a 4% em PBS e deixe as células em repouso por 15 minutos. À temperatura ambiente, lave as células adicionando um mililitro de tampão de permeabilização, em seguida centrifugue a 250 × g durante 10 minutos a quatro graus Celsius.

Após descartar o sobrenatante, remova o tampão residual como antes. Em seguida, para corar as células RAW 264.7. Para actina, adicione 100 microlitros de tampão de permeabilização e lavagem contendo Alexa Fluor foid em seis 60 por 15 minutos.

À temperatura ambiente, as amostras não coradas devem ser incubadas com o tampão de permeabilização, sem phin. Após a coloração, lave e centrifugue as células novamente, depois reconstitua-as em 50 microlitros de PBS contendo 1% de PFA e armazene-as no escuro a quatro graus Celsius até a aquisição. Ligue, visualize o fluxo de imagens e inicie.

Ative e inicialize a fluidica no menu de arquivos. Escolha carregar modelo padrão. Na galeria de imagens, no menu exibir, selecione tudo e pressione executar configuração para iniciar a aquisição de imagens das microesferas; se necessário, ajuste o rastreamento do núcleo para centralizar as imagens lateralmente.

Selecione o canal de campo claro e clique em definir intensidade. Aguarde até que o coeficiente de variação da velocidade de fluxo seja consistentemente inferior a 0,2%. Na guia assistência, clique em iniciar tudo para executar calibrações e testes e verifique se todos foram aprovados no software. Clique em carregar amostra.

Em seguida, quando orientado a fazê-lo, coloque o tubo contendo a amostra mais brilhante. Com todos os fluorocromos no carregador de amostras, selecione a ampliação de 40 x. Uma vez estabelecidas as configurações do instrumento, não as altere durante todo o experimento.

Ligue cada laser do experimento clicando nos ícones dos lasers no software e ajuste a potência do laser para que cada fluorocromo tenha valores máximos de pixel entre 104.000 contagens, conforme medido nos gráficos de dispersão. Para eliminar a coleta de objetos indesejados, clique na janela classificadora de células no software. Em seguida, para coletar apenas dados de células, selecione o canal um com limite inferior para o campo claro e defina o valor em 50 micrômetros; objetos com área menor que 50 micrômetros serão considerados detritos e não serão adquiridos.

Selecione os canais a serem coletados clicando nos ícones de canal apropriados no software aqui. Os canais 1, 2, 3, 4, 5 e 6 são selecionados na guia de configuração. Insira o número do arquivo e a pasta de destino.

Defina o número de sequência como um e o número de eventos a serem adquiridos como 5.000. Clique em executar, adquirir para coletar e salvar o arquivo de dados do primeiro experimento. Clique em FLL e execute a próxima amostra experimental.

Repita até que todas as amostras experimentais tenham sido coletadas. Em seguida, para executar os controles, clique em configurações de compensação. Isso desativará o campo claro e o laser de dispersão e permitirá a coleta de todos os canais de fluorescência na guia adquirir.

Altere o valor de entrada para 500. Em seguida, coloque o tubo controle e clique em executar. Adquira para coletar 500 células positivas nos controles manchados individualmente.

Repita para cada fluorocromo no experimento para desenvolver uma matriz de compensação. Após todas as imagens das amostras terem sido adquiridas, inicie o software de análise ideas em um computador de análise separado clicando duas vezes no ícone do ideas na área de trabalho. Clique duas vezes no assistente de internalização e carregue um dos arquivos RIF da amostra de teste.

Uma janela pop-up fornecerá instruções para carregar os arquivos de teste. Siga as instruções e clique no botão próximo. Em seguida, clique em nova matriz.

Isso iniciará o assistente de compensação. Quando solicitado, selecione os arquivos de dados para os controles de cor única para adicioná-los. Clique em próximo no assistente, seguindo as instruções, até que o arquivo da matriz de compensação seja salvo e carregado na caixa na etapa dois do assistente de internalização.

Clique em próximo e siga as instruções até que um arquivo DAF seja gerado. Defina as propriedades de exibição da imagem selecionando os canais de imagem utilizados durante a aquisição. Clique no canal dois para FITC e no canal cinco para AF 606.

Brightfield e dispersão lateral são selecionados por padrão. Selecione o canal Brightfield O1 para delimitar o contorno celular e o canal O2, no qual nanopartículas ou bactérias foram coletadas para a sonda de internalização, a fim de definir a população de células individuais; é gerado um gráfico de dispersão da área em brightfield versus razão de aspecto em brightfield de todas as células. A análise de alto rendimento de múltiplos arquivos de dados exige um arquivo modelo, sendo, portanto, de importância crítica definir cuidadosamente as portas (gates) ao criar um arquivo modelo.

Cada ponto representa os valores de uma imagem individual de célula. Clique em um único ponto de um gráfico para selecionar a imagem daquela célula específica na galeria de imagens.

Em seguida, desenhe um gate ao redor das células com a área e razão de aspecto que correspondem a eventos de célula única. Células únicas possuem uma razão de aspecto próxima a um, enquanto dupletos possuem uma razão de aspecto em torno de 0,5.

Clique em múltiplas células para diferenciar a região contendo células únicas de dupletas ou detritos. Para gerar um histograma da raiz quadrada média do gradiente da imagem de campo claro. Clique no botão seguinte.

Em seguida, na guia população, selecione a opção bin para exibir o bin selecionado. Clique nos bins para determinar onde estão as células e o melhor foco. Inicie e desenhe uma região em linha para rastrear as células focadas.

Quanto maior o RMS do gradiente, melhor o foco; pule o próximo passo, a menos que haja outras colorações para seleção. Um novo gráfico de dispersão da intensidade do canal dois no eixo X versus o pixel máximo do canal dois no eixo Y é gerado. Clique nos pontos e visualize as imagens para ajudar a determinar a região a ser desenhada ao redor das células positivas para nanopartículas ou bactérias.

É gerado um histograma da característica de internalização com uma região que começa em zero, a qual deve ser ajustada mediante a observação de imagens. A característica de internalização é uma razão entre a intensidade no interior da célula e a intensidade de toda a célula. Ela é escalonada de modo que, em um valor de zero, metade da intensidade esteja no interior.

O assistente criou uma região de cada célula que define o interior, gerando uma máscara utilizada como entrada na imagem da célula para identificar a superfície celular, a qual foi erodida em quatro pixels. Observe que essa máscara pode ser ajustada manualmente para diferentes tipos celulares quando necessário, criando primeiro uma máscara de objeto na imagem de campo claro e erodindo-a com mais ou menos pixels. A característica de internalização é calculada com base nessa máscara de objeto erodida, utilizando um algoritmo presente no software.

Este recurso permite-nos distinguir partículas e bactérias internalizadas, que possuem a maior parte do seu sinal fluorescente dentro do limite da máscara, de partículas e bactérias ligadas à superfície, que possuem a maior parte do seu sinal fluorescente fora do limite da máscara, conforme mostrado neste exemplo. Crie um novo histograma com um novo parâmetro de internalização baseado na máscara de objeto erodida. Desenhe uma região para definir um gate em células internalizadas visualizando a imagem no modo de bin selecionado. Defina o gate em 0,3. Aqui.

Células com pontuação inferior a 0,3 são consideradas células positivas para partículas ligadas à superfície. Para eliminar as células com marcação de fundo e identificar nanopartículas ou bactérias internalizadas específicas, escolha características no menu de análise. Clique no menu de análise.

Em seguida, clique na função de contagem de colônias ao lado para adicionar a contagem média de colônias ao relatório de estatísticas. No menu de relatórios, clique no ícone de relatórios. Depois, defina o relatório de estatísticas, adicione colunas e selecione a população celular apropriada.

Clique em OK. O assistente de internalização adicionará automaticamente estatísticas a este relatório para salvar o arquivo de dados como um arquivo modelo a ser usado na análise em lote de todos os arquivos experimentais. Clique no menu arquivo e selecione salvar como modelo.

Arquivos modelo. Possuem a extensão dot AST para analisar múltiplos arquivos de dados no software Idea. Clique em Ferramentas e selecione arquivos de dados em lote e insira todos os arquivos RIF.

Adicione o arquivo da matriz de compensação e o arquivo modelo nas seções correspondentes para enviar o lote para processamento; clique em enviar. Após a etapa de processamento, todos os arquivos RAF são analisados e arquivos DAF são gerados para cada um dos arquivos brutos individuais. Um relatório final é gerado com estatísticas para todas as amostras, a fim de comparar o efeito da inibição da actina e da baixa temperatura na fagocitose de salmonela e nanopartículas.

Células RA W2 64,7 foram incubadas a 37 graus Celsius em meio, com ou sem citocalasina D ou incubadas em meio a quatro graus Celsius. Tanto a temperatura quanto as manipulações da actina reduziram a internalização de nanopartículas e de salmonela. No entanto, a incubação das células com citocalasina D aumentou a porcentagem de células com nanopartículas ligadas à superfície, enquanto diminuiu a porcentagem de células com salmonela ligada à superfície.

A porcentagem de células positivas para nanopartículas ligadas à superfície aumenta de aproximadamente 8% a 37 graus Celsius para mais de 35% após tratamento com citocalasina D ou a 4 graus Celsius. Em contraste, a porcentagem de células com *Salmonella* ligada à superfície reduziu-se de 35% para 15% após tratamento com citocalasina D. A incubação de células RAW 264.7 com *Salmonella* a 4 graus Celsius diminuiu a internalização sem um aumento aparente na quantidade de bactérias ligadas à superfície, em comparação com o controle a 37 graus Celsius. Em conjunto, esses dados demonstram que *Salmonella* e nanopartículas são internalizadas por um processo celular semelhante que requer actina e é dependente da temperatura.

Além disso, os dados indicam que a adesão sustentada de salmonela a macrófagos requer polimerização de actina. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como examinar a internalização celular de nanopartículas e bactérias por citometria de fluxo com imagem multiespectral. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que os inibidores são citotóxicos.

Portanto, são necessários experimentos prévios de perfilagem de citotoxicidade para determinar as concentrações ideais a serem utilizadas. Não se esqueça de que trabalhar com salmonela pode ser perigoso; precauções, como o uso de equipamentos de proteção individual apropriados e a evitação da formação de aerossóis, devem ser observadas ao realizar este procedimento.