Um método passo-a-passo para a reconstituição de um transportador ABC em partículas lipídicas Nanodisc

O objetivo geral deste procedimento é incorporar um transportador A, b, C. Neste caso, o transportador de maltose malf GK dois em partículas solúveis de nanodiscos de membrana. Isso é realizado primeiramente misturando a proteína de suporte de membrana MSP com o transportador e a quantidade correta de lipídios em micelas de detergente.

O segundo passo é adicionar as esferas de poliestireno e agitar suavemente a mistura durante a noite; o detergente é progressivamente absorvido pelas esferas, permitindo a formação das partículas de nanodisco. Em seguida, as esferas são removidas por sedimentação. O passo final é separar os discos adequadamente formados de agregados e proteínas de estrutura não montadas por meio de cromatografia de filtração em gel.

Por fim, a qualidade dos discos é avaliada por eletroforese em gel nativo ou espectroscopia de espalhamento de luz. A principal vantagem desta técnica em relação a outros métodos, como lipossomos, é que as proteínas de membrana e os discos são perfeitamente solúveis em solução aquosa. Além disso, os domínios proteicos agora estão acessíveis de ambos os lados.

Como agora não há mais compartimentação de membrana, utilizando proteínas de sustentação de membrana de diferentes comprimentos, foi possível aprisionar e estudar os diferentes estados conformacionais de proteínas de membrana. Mais importante ainda, este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de proteômica de membrana, como a identificação de novos parceiros de ligação de transportadores a, b, C. Na verdade, as implicações desta técnica estendem-se ainda mais para a terapia, pois podem auxiliar na descoberta de ativadores ou inibidores de proteínas e receptores de membrana.

Embora este método pareça simples, é necessário ter cautela ao escolher a proporção correta entre proteínas e lipídios. Geralmente, indivíduos novos neste método enfrentam dificuldades ao calcular a proporção molar correta ou ao realizar os controles adequados que garantam a qualidade do preparo. Por isso, uma demonstração visual deste método é muito útil para que um estudante iniciante aprenda as diversas etapas e as dificuldades potenciais.

Para iniciar a expressão da MSP com marcação de hexa-histidina em *E. coli* cepa BL21(DE3) a partir do plasmídeo pMSSP1D, induza a produção da proteína quando a densidade óptica medida a 600 nanômetros for de aproximadamente 0,5, durante três horas a 37 graus Celsius. Recolha as células por centrifugação a 5.000 ×g por 10 minutos a 4 graus Celsius. Re-suspenda o pellet em tampão TSG10 contendo 100 micromolar de PMSF. Lisar as células com prensa francesa três vezes a 8.000 psi. Remova o material insolúvel por centrifugação a 5.000 ×g por 10 minutos a 4 graus Celsius. Em seguida, isole a fração solúvel contendo a MSP por ultracentrifugação a 125.000 ×g por 45 minutos.

Realize a purificação da MSP por cromatografia de afinidade com níquel, utilizando aproximadamente 1,5 mililitro de níquel seros de alta performance no tampão TSG 10. Remova os contaminantes com o tampão TSG 10 contendo 50 milimolares de ILE. Elua a MSP com o tampão TSG 10 contendo 600 milimolares de imidazol após a diálise.

A proteína purificada no tampão TSG 10 MSP pode ser armazenada a menos 70 graus Celsius e uma concentração de proteína de aproximadamente 10 a 15 miligramas por mililitro. O complexo MALF GK dois, com marcação de histidina na extremidade C do MAL K, é expresso a partir do plasmídeo. PED 22 FG K cultivado na linhagem de E. coli BL 21 DE três induz a produção da proteína quando a densidade óptica medida em 600 nanômetros for de cerca de 0,5 com 0,2% L-Arabinose por três horas a 37 graus Celsius, após lise celular e centrifugação.

Como antes, suspendemos o pellet da membrana no tampão TSG 20 até uma concentração final de cinco miligramas por mililitro. Em seguida, solubilizamos o material com 1% peso por volume de GDM durante três horas a quatro graus Celsius com agitação suave. Removemos o material insolúvel por ultracentrifugação, como no caso da purificação da MAL FTK dois.

Em seguida, colete o sobrenatante contendo o complexo mal FTK dois solubilizado e purifique novamente por cromatografia de fixação de níquel. Purifique ainda mais o complexo por cromatografia de filtração em gel no tampão TSGD em uma coluna SUEx 200, HR 10/300, com uma vazão de 0,5 mililitros por minuto. Para preparar os fosfolipídios, um extrato lipídico total de e coli dissolvido em clorofórmio é separado em alíquotas de 1000 anomal em tubos microficha com tampa rosqueável; evapore o solvente sob um fluxo suave de nitrogênio e deixe secar ainda mais durante a noite em vácuo.

Em seguida, desseque, dissolva o filme lipídico no tampão TS a uma concentração final de cinco NMO e vórtice vigorosamente, depois sonique em pulsos cinco vezes por aproximadamente cinco segundos. Os lipídios dissolvidos aparecerão ligeiramente opacos devido à sua baixa solubilidade geral no tampão TS aquoso, mas devem permanecer em suspensão. Adicione DDM até uma concentração final de 0,5%. Neste ponto, a solução ficará clara; coloque a mistura lipídica em banho-maria e sonique em pulsos cinco vezes por aproximadamente cinco segundos.

A mistura de lipídios pode ser armazenada a quatro graus Celsius por um máximo de uma semana. Para preparar as bioesferas, coloque aproximadamente 10 a 15 mililitros de bioesferas em um tubo de 50 mililitros. Primeiro, lave as esferas com 50 mililitros de metanol a 100%.

Deixe as esferas sedimentarem por gravidade e, em seguida, descarte cuidadosamente a solução. Repita o processo uma vez para metanol e depois duas vezes cada para etanol 95%, água milli Q e, finalmente, tampão TS. Inicie a constituição nano discreta diluindo MSP no tampão TSGD até a concentração final de aproximadamente sete miligramas por mililitro ou 0,3 milimolar.

Para garantir um experimento bem-sucedido, é importante escolher as proporções corretas de lipídios e proteínas a serem misturados. Misture aproximadamente dois M do complexo purificado malf GK dois em uma proporção de proteína para MS P para lipídio de um para três para 60 no tampão TSGD, para um volume final de 300 microlitros. Aqui, uma amostra de lipídio em excesso na proporção de um para três para 400 também é preparada como controle negativo. Adicione 50 microlitros de suspensão de bio perlas ao tubo e incube a mistura durante a noite em mesa agitadora a quatro graus Celsius. No dia seguinte, sedimente as perlas por gravidade. Uma vez que as perlas tenham sedimentado, pipete a solução através de uma ponta estreita para evitar o máximo possível de bio perlas.

Remova os grandes precipitados por ultracentrifugação a 100.000 ×g durante 20 minutos. Em seguida, purifique os discos por cromatografia de filtração em gel, conforme realizado anteriormente no tampão TSG 10. A seguir, injete um Eloqua na mesma coluna de filtração em gel para testar a estabilidade da preparação.

Em seguida, reúna as frações contendo os discos. A qualidade do preparo é avaliada por eletroforese nativa em gel. Analise um micromolar de nano discos para avaliar a qualidade da reconstrução.

Também avalie a ligação de mal E ao complexo mal ftk dois reconstituído em nanodiscos. Após a eletroforese, cora o gel com azul de Kumasi por 10 minutos e detenha por aproximadamente uma hora. Para realizar espalhamento dinâmico de luz ou DLS, purifique primeiro os nanodiscos por cromatografia de filtração em gel como antes, utilizando uma coluna SUEx 200 HR 10/300 com uma taxa de fluxo de 0,1 mililitros por minuto.

Agrupe as frações contendo os nanodiscos e concentre até aproximadamente 10 miligramas por mililitro utilizando um filtro centrífugo AmCon. Em seguida, filtre a amostra duas vezes. Realize a análise por DLS usando um instrumento Dynapro Nano Star em uma cubeta de quartzo com volume interno de um microlitro.

Utilizando o software dinâmico para estimar o diâmetro e o peso molecular das partículas, determine a atividade de A TPAs em dois nano discos reconstituídos de mal FTK por meio de um ensaio colormétrico. Primeiro, misture um micromolar de discos purificados e um milimolar de A TP com quantidades crescentes de mal e. Incube as amostras a 37 graus Celsius por 20 minutos.

Em seguida, meça a liberação de fosfato inorgânico a 660 nanômetros. Compare a quantidade de fosfato liberado com uma curva padrão gerada com uma solução padrão de fósforo. Os nanodiscos são purificados por cromatografia de filtração em gel.

O cromatograma mostra que a maioria dos discos reconstituídos elui como um único pico, enquanto os discos preparados com excesso de lipídios eluem no volume de exclusão e como uma série de picos largos. A qualidade do preparo dos discos é analisada adicionalmente por eletroforese em gel nativo: discos reconstituídos com uma quantidade limitada de lipídios migram como uma faixa nítida no gel nativo, enquanto aqueles reconstituídos na presença de excesso de lipídios migram como manchas difusas. A análise por DLS mostra que a população de discos é homogênea, com um raio médio de 5,0 nanômetros. Com base na aproximação de DLS, os discos reconstituídos têm um peso molecular aparente de 215 quilodaltons. Amostras reconstituídas na presença de excesso de lipídios exibem raios amplamente distribuídos em torno de 100 nanômetros, o que é típico para amostras não homogêneas.

A atividade do complexo MAL FTK dois é avaliada medindo a taxa de hidrólise de TP e a afinidade por parceiros de interação, como a proteína de ligação à maltose, MAL E, a proteína de ligação à maltose. MAL E liga-se com alta afinidade ao transportador MAL FTK dois utilizando eletroforese em gel não desnaturante. É possível detectar um complexo entre MAL E e MAL FTK dois; a estimulação da atividade MAL KA TPA por MAL E é mostrada aqui em função da concentração de MAL E.

A produção do nano disco é relativamente simples, mas pequenas variações em relação às condições ideais podem levar à agregação irreversível de proteínas; uma vez dominada, essa técnica pode ser realizada em menos de dois dias. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar da importância de escolher uma proporção adequada entre proteína e lipídio, pois um excesso de lipídios resultará na produção de grandes partículas polidispersas semelhantes a lipossomos. Por isso, é crucial analisar cuidadosamente a qualidade do material reconstituído utilizando técnicas diferentes da filtração em gel, como espectroscopia de espalhamento de luz, ultracentrifugação analítica ou, de forma mais simples, eletroforese nativa em gel.

Lembre-se, o tipo de fosfolipídio que incorpora o disco, bem como o da proteína de suporte da membrana, pode influenciar a eficiência da reconstituição. Após assistir a este vídeo, esperamos que você tenha compreendido bem como gerar discos nano solúveis e homogêneos contendo sua proteína de membrana de escolha. Boa sorte em seus experimentos.