Análise otimizado de metilação do DNA e expressão gênica de pequenas áreas anatomicamente definidos do Cérebro

O objetivo geral deste procedimento é estudar a metilação do DNA e as alterações na expressão gênica decorrentes do estresse na primeira infância. Isso é realizado primeiramente submetendo filhotes recém-nascidos de camundongo à separação materna para induzir estresse precoce; em um segundo passo, as áreas cerebrais de interesse, aqui o núcleo paraventricular (PVN), são obtidas por microdissecação in loco, e o DNA e o RNA são isolados simultaneamente de um único fragmento de tecido.

Em seguida, o DNA obtido é tratado com sulfito e a região de interesse é amplificada por PCR com bisulfito. Em seguida, o produto é ligado a um vetor e transformado em bactérias. Transformações bem-sucedidas são identificadas pela expressão do marcador e pelo tamanho do fragmento de PCR.

E, por último, o sequenciamento de bissulfeto é utilizado para avaliar o status de metilação. A principal vantagem desse fluxo de trabalho é que ele permite uma análise conveniente da programação epigenética em resposta a estímulos ambientais. Este método pode fornecer informações sobre a programação epigenética decorrente da adversidade na primeira infância.

Ele também pode ser aplicado a outros sistemas. Sempre que a metilação e a expressão gênica forem analisadas em ambientes altamente específicos de tecido e sempre que a disponibilidade de tecido for limitada para induzir estresse na vida precoce. A separação materna é realizada em filhotes de mães C57 black six N prenhes com tempo controlado para provocar separação materna.

Transfira cada ninhada para uma gaiola limpa aquecida por três horas diárias, do primeiro ao décimo dia pós-natal; mantenha as ninhadas controle sem estresse intactas. Exceto pela separação de três horas, todas as ninhadas permanecem com suas mães até o desmame no 21º dia pós-natal. Em seguida, os filhotes são alojados em grupos com animais do mesmo sexo, três a cinco camundongos por gaiola, em condições padrão de alojamento. Para iniciar a coleta de tecido cerebral, os cérebros dos camundongos são removidos dos crânios e imediatamente congelados em gelo seco de isopentano e armazenados a menos 80 graus Celsius.

Quando estiver pronto para coletar os fragmentos teciduais, retire os cérebros do freezer a menos 80 graus e coloque-os sobre gelo seco. Inicie o corte criosecional dos cérebros em seções coronais de 10 mícrons, da região rostral até a caudal. Monte as seções em lâminas de vidro super frosts e seque-as para coloração com violeta de cresil.

Pode-se coletar lâminas adicionais e armazená-las a menos 20 graus para análises posteriores, como hibridização in situ. Quando estiver pronto para coletar os fragmentos, corar as lâminas com violeta de cresila para identificar as estruturas cerebrais de interesse. Em seguida, utilizando uma agulha de punção, obter fragmentos de 0,8 milímetro das regiões de interesse por meio de microdissecção in loco.

Os fragmentos devem ser armazenados a menos 80 graus Celsius. É de importância crítica que o microfracionamento seja realizado de maneira padronizada, pois a expressão gênica e a metilação são altamente específicas do tecido. Homogeneíze os fragmentos em 400 microlitros de tampão de tiocianato de guanidina usando uma pipeta e, em seguida, vortexe à temperatura ambiente.

Em seguida, passe o lisado resultante por uma seringa de 29 gauge. Várias vezes, o punch não deverá mais ser visível. Divida o lisado em partes iguais.

Um para processar RNA, o qual deve ser feito primeiro, e outro para processar DNA, que pode ser armazenado à temperatura ambiente até que o RNA seja processado para purificação de RNA com um décimo de volume de acetato de sódio, um volume de fenol aquoso e meio volume de clorofórmio a isoamil 24:1. Agite vigorosamente a mistura após cada adição e incube a mistura final em gelo por 10 minutos. Em seguida, centrifugue a mistura.

Colete a fase aquosa e adicione um volume igual de etanol a 70%. Utilizando um kit de coluna de RNA, realize a digestão do DNA na coluna e elua o RNA em 25 microlitros de água.

Agora, purifique o DNA utilizando um protocolo de kit modificado para incluir a digestão com RNase e para aquecer o tampão de eluição e a coluna de eluição a 70 graus Celsius antes do uso. Dez minutos a 70 graus Celsius são suficientes para as colunas. Por fim, utilize um espectrofotômetro para determinar as concentrações de DNA e RNA.

Um fragmento típico do NPV produz cerca de 600 nanogramas de DNA e cerca de 400 nanogramas de AR separados, sendo cerca de 100 nanogramas de ARN destinados à análise de expressão gênica por PCR quantitativa antes da amplificação por sulfito. Trate 200 nanogramas do DNA isolado com um kit comercialmente disponível para amplificar o DNA das regiões metiladas. Solicite primers projetados especificamente para DNA convertido por bisulfito. O desenho ideal de primers na PCR com bisulfito é essencial, pois a qualidade e a especificidade do amplicon de PCR determinam o sucesso das etapas seguintes.

Quando os primers chegarem, determine sua temperatura ótima e de joelho com experimentos piloto. Use dois microlitros de DNA tratado com bissulfito como molde para cada mistura de PCR de 25 microlitros.

Amplifique a mistura iniciando com uma desnaturação de seis minutos a 95 graus Celsius, seguida por 45 a 50 ciclos de amplificação antes de uma elongação final de cinco minutos a 72 graus Celsius. Analise sete microlitros do produto de PCR por eletroforese em gel de agarose para verificar o tamanho do amplicon. Purifique o produto remanescente de PCR para a subsequente ligação utilizando um kit comercialmente disponível para purificação de PCR.

Se forem obtidos produtos indesejados de PCR, utilize purificação em gel para isolar o produto de interesse para este protocolo. Um kit comercial de clonagem é empregado. A eficiência de clonagem depende criticamente do inserto.

Portanto, se forem obtidos repetidamente baixos números de clones recombinantes, experimente um vetor de clonagem diferente. Prepare uma reação de ligação de 10 microlitros com um microlitro de vetor e três microlitros do produto de PCR purificado. Misture a reação por pipetagem e incube-a durante a noite a quatro graus Celsius no dia seguinte.

Limpe a reação de ligação por precipitação clássica com etanol e transforme as bactérias com o produto. Adicione um mililitro de meio SOB pré-aquecido imediatamente após a aplicação do pulso e transfira as bactérias transformadas para um tubo de reação. Após recuperar as bactérias por uma hora a 37 graus Celsius, espalhe 100 microlitros de cada suspensão em uma placa de LB com ampicilina revestida com IPTG.

Incubar as placas durante a noite assim que as colônias puderem ser selecionadas. Preparar reações de PCR de colônia de 25 microlitros em uma placa de 96 poços, utilizando três microlitros de cloreto de magnésio 2,5 milimolar em cada reação. Selecionar os clones brancos positivos com a ponta de uma pipeta e transferi-los para a mistura de PCR com um simples mergulho.

Inicie a PCR com um ciclo de desnaturação de quatro minutos. Em seguida, realize 10 ciclos de amplificação com uma temperatura de pareamento de 56 graus Celsius. Cada etapa desses ciclos dura 30 segundos.

Em seguida, reduza a temperatura de annealing para 48 graus Celsius por mais 30 ciclos de amplificação. Finalize com um ciclo de alongamento de cinco minutos. Agora, carregue cinco microlitros de cada produto em um gel de aros e identifique as reações que contêm o inserto de tamanho correto.

Utilize um kit comercialmente disponível para purificar os produtos de PCR de interesse, de modo que possam ser sequenciados usando a reação de ciclo de terminador big dye. Em uma placa de 96 poços, carregue os poços com três microlitros da mistura mestra de reação big DI, seguidos por dois microlitros do produto de PCR de colônia purificado. Execute a reação em um termociclador iniciando com um minuto a 96 graus Celsius, seguido por 35 ciclos de 10 segundos a 96 graus Celsius, cinco segundos a 50 graus Celsius e quatro minutos a 60 graus Celsius.

Após a conclusão da reação big die, realize a purificação da reação utilizando uma placa de purificação big die. Após obter as sequências, analise-as usando o big analyzer online ou a ferramenta B-I-S-M-A para derivar o padrão de metilação da região de DNA investigada e obter informações sobre a influência do estresse na vida inicial ou ELS na expressão e no status de metilação de VP. C 57 bastões pretos e camundongos foram processados de acordo com o protocolo descrito, o núcleo paraventricular e o núcleo supraóptico foram perfurados para isolamento de DNA e R-N-A-D-N-A foi tratado com bisulfito, amplificado com iniciadores específicos para o potenciador de VP e os produtos de PCR foram clonados e sequenciados, analisando-se pelo menos 20 clones recombinantes de cada camundongo.

As PCR foram analisadas para determinar as frequências de metilação dos CPGs contidos no amplicon da PCR em tecido da P-V-N-E-L-S, que induziu uma hipometilação significativa em quatro locais no enhancer do A VP, sugerindo uma marcação epigenética dessa região reguladora por meio de experiências na primeira infância. Em contraste com a PVN, a metilação do enhancer do A VP não foi afetada pelo ELS no SON, ilustrando a especificidade tecidual do efeito epigenético. Em animais controle, o status de metilação do DNA no CPG 10 correlacionou-se negativamente com a expressão do gene VP, indicando um papel da metilação do DNA no ajuste fino da expressão gênica do VP. Após este procedimento, outros métodos como a UPCR podem ser facilmente realizados sobre o RNA isolado, a fim de responder a questões adicionais, como alterações na expressão gênica no tecido analisado.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como estudar alterações na metilação do DNA em resposta a estímulos dependentes do ambiente ou da experiência.