Alta capacidade de síntese de hidratos de carbono e funcionalização de nanopartículas polianidrido

Neste artigo em vídeo, descrevemos um novo protocolo de hidroponia para a síntese automatizada em fase líquida de oligossacarídeos e a funcionalização de nanopartículas de polianidrido. Com esses agentes de direcionamento baseados em carboidratos, primeiramente moléculas de carboidratos são sintetizadas usando um sistema automatizado que utiliza síntese em fase líquida em vez de sintetizadores em fase sólida. Em seguida, os intermediários de oligossacarídeos são purificados por extração em fase sólida florística ou FSPE.

As moléculas de carboidrato produzidas são caracterizadas por RMN e, em seguida, ligadas às nanopartículas de polianidrido por meio de conjugação carbo IDE. Por fim, as nanopartículas funcionalizadas com carboidratos são caracterizadas por espectroscopia de fotoelétrons com raios X e por ensaio de ácido fenil sulfúrico hidrofílico. Em última análise, utilizando a metodologia hidrofílica descrita aqui, foram obtidas as condições reacionais para otimizar a morfologia das nanopartículas e a densidade de carboidratos na superfície das partículas.

A principal vantagem deste método em relação aos métodos existentes, como a síntese de oligossacarídeos em fase sólida, é que nele utilizamos uma quantidade significativamente menor de blocos de construção. Neste método, normalmente utilizamos duas a três equivalentes, em vez de 10 a 20 equivalentes. Tivemos pela primeira vez a ideia deste método quando demonstramos a eficácia dos efeitos de superfície na funcionalização de nanopartículas poliméricas hidrofóbicas, utilizando carboidratos para direcionar receptores em células antígenas. Em seguida, desejamos projetar um sistema de alto rendimento que nos permitisse analisar os múltiplos parâmetros envolvidos na fabricação e aplicação desses novos veículos.

A demonstração visual deste método é essencial porque o desenvolvimento de plataformas automatizadas para a síntese em alto rendimento de oligossacarídeos e sua ligação a partículas poliméricas é uma área de investigação nova, sem muita documentação disponível antes da síntese automatizada do ácido diano. Um doador de açúcar adequadamente protegido, tipicamente tri-cloro-acetamida, e um aceitador principalmente em Alcon, álcool fluoro são sintetizados na bancada e preparados em clorometano; também prepare trimetil silano e trifluormetano sulfonato em clorometano, metanol 80% e metanol 100%. Certifique-se de que a umidade relativa no ambiente seja de 30% ou menos na câmara de automação.

A alta umidade é prejudicial para reações de glicosilação. Os seguintes passos são realizados utilizando uma plataforma automatizada. A primeira glicosilação é realizada com o doador e o álcool florista.

Após a conclusão, a molécula de açúcar marcador florístico resultante é purificada por FSPE. O grupo protetor temporário é então removido com sódio, metóxido e metanol, e novamente o produto é purificado por FSPE. Em seguida, o açúcar marcador florístico é usado como aceitador e acoplado ao mesmo doador para obter o dissacarídeo, que é purificado por FSPE para iniciar o processo.

Coloque os reagentes, incluindo o doador, o aceitador e o promotor, água com 80% de metanol, metanol 100% e metóxido de sódio na plataforma robótica e inicie o programa. O braço robótico irá retirar o doador e, em seguida, o aceitador dos frascos e transferi-los para um frasco de reação. Em seguida, a mistura de doador e aceitador é agitada por 30 minutos.

Após 30 minutos. O braço robótico transfere o catalisador trimetil silil trifluorometano sulfonato para a mistura. A solução é então agitada por mais 30 minutos. Após a agitação, o programa pausa.

Retire uma alíquota de 10 microlitros para verificar se a reação está completa por meio de cromatografia em camada delgada. Se a reação estiver completa, a molécula aceitadora não será vista. Se a reação não estiver completa, o aceitador na TLC ainda será visível.

Se este for o caso, interrompa o programa, redefina o tempo de glicosilação em cerca de 30 minutos e adicione um excesso do promotor trimetil silo, trifluoro, metanosulfonato. Quando a reação estiver completa, prossiga com a próxima etapa. Após a conclusão da reação, o robô transfere a mistura reacional para cartuchos FSPE contendo gel de sílica modificado com C nine F 17 para purificação.

Em seguida, as cartuchas são lavadas com oito mililitros de metanol a 80%, seguidos por oito mililitros de metanol a 100%. Para eliminar a fração não floris, o fluxo que atravessa é coletado em um frasco para obter o produto marcado florist desejado. Se for necessária purificação adicional, pause o robô e remova os produtos da reação apropriados.

Dependendo da estrutura, os doadores podem ser extremamente pouco reativos e alguma molécula aceitadora de flor pode permanecer mesmo após a adição de promotor em quantidade suficiente. Nesse caso, a FSPE não será eficiente o suficiente para a purificação, e uma purificação adicional por meio de cromatografia em coluna de gel de sílica pode ser realizada após a purificação, enquanto o braço robótico dispensa metóxido de sódio no vial de reação. A reação é então agitada por duas horas na plataforma robótica; se não estiver completa, conforme determinado por TLC, prolongue o período de incubação em aproximadamente uma hora.

Após a conclusão da reação, o produto é purificado por FSPE como anteriormente. Em seguida, remova o produto da reação do robô e, na bancada, submeta-o à dissolução em tolueno anidro, seguida de evaporação para remover a água residual. Uma vez que a amostra esteja seca, coloque-a novamente no robô, repetindo o mesmo ciclo, incluindo a purificação por glicosilação por FSPE.

A proteção profunda do grupo protetor temporário seguida por glicosilação é repetida até que o comprimento da cadeia desejado seja obtido para a molécula-alvo; para desproteger o produto protegido obtido da automação, remova o vial do robô. Os passos finais do procedimento utilizam gás hidrogênio explosivo e devem ser realizados fora da plataforma de automação. Na bancada, a clivagem da ligação dupla na etiqueta florista ocorre e é seguida pela oxidação do aldeído produzido em ácido carboxílico.

Realize a purificação do produto resultante por cromatografia em coluna de gel de sílica em bancada, utilizando uma mistura de 30% de metanol em diclorometano. Por fim, para desproteger os grupos benzo éter por hidrogenação catalisada por paládio, passe o produto através de uma placa satélite para remover o paládio e obter o produto final puro. Caracterize completamente o produto utilizando ressonância magnética nuclear ou espectroscopia de RMN.

A síntese de polímeros com alto rendimento e a fabricação de nanopartículas são realizadas seguindo o protocolo descrito por Peterson et al. Conforme referenciado no documento suplementar, o equipamento automatizado de deposição utilizado para funcionalização de partículas consiste em três bombas ne 1000, uma plataforma robótica integrada por dois atuadores, um para movimento na direção X e outro para movimento na direção Y, e uma segunda plataforma robótica com dois suportes adjacentes constituídos por três atuadores, um para cada direção, além das bombas, totalizando cinco atuadores conectados. Os atuadores e bombas em série são operados por um computador utilizando o software LabVIEW.

Os sistemas de copolímeros utilizados para a fabricação de partículas baseiam-se no ácido SEBA ou SA e um seis bis, paraicarboxi, oxil heano ou CPH e um oito BIS para-carboxi fenoxi três seis dioxano ou CP Teeg. Após a fabricação das nanopartículas, coloque uma grade contendo os tubos de centrifugação de 1,7 mililitro com uma biblioteca de nanopartículas na plataforma do atuador linear para a fixação de carboidratos à superfície das partículas de polianidrido, e realiza-se uma reação média de acoplamento de ácido carboxílico consistindo em duas reações consecutivas. Para a primeira reação, preencha uma seringa em uma bomba de seringa programável com uma solução aquosa de EDC e etilenodiamina nas concentrações de dois miligramas por miligrama de nanopartículas e 0,6 miligramas por miligrama de nanopartículas, respectivamente.

Encha uma segunda seringa em uma bomba de seringa programável com 2,5 miligramas por miligrama de partículas de NHSA, no total de 12 equivalentes por amostra de nanopartícula, uma solução aquosa. Em seguida, utilizando o programa LabVIEW, instrua o robô a depositar suspensões de reagentes na biblioteca de nanopartículas. Os atuadores do robô moverão então o porta-tubos para a posição correta na plataforma para a dispensação das soluções, EDC e NHS.

Ative os grupos ácido carboxílico na superfície das nanopartículas de polianidrido e permita um acoplamento médio. Em seguida, submerja uma sonda de sonicação em cada tubo e sonique cada amostra por 30 segundos a 40 hertz. Antes de passar para a próxima amostra, limpe a sonda com acetona.

Após todos os amostras estarem preparadas, o suporte para tubos é destacado da plataforma robótica. Incube as suspensões de nanopartículas durante nove horas com rotação constante a quatro graus Celsius. Os tempos de reação para a primeira e segunda reações podem ser alterados para ajustar a concentração final de sacarídeo.

Após a conclusão da reação, centrifugue os tubos a 12.000 vezes G durante cinco minutos. Em um ambiente frio, retorne à estação robótica. Reative o suporte de tubos ao braço robótico e preencha a segunda seringa na plataforma robótica.

Com água fria, a primeira seringa deve permanecer vazia. Inicie o robô. O sobrenadante em cada tubo é aspirado para a seringa vazia e a segunda bomba deposita água fria nos tubos.

Esta etapa é realizada para remover quaisquer reagentes inativos das suspensões de nanopartículas. Em seguida, homogeneíze a suspensão de nanopartículas por sonicação, conforme demonstrado anteriormente. Então, centrifugue os tubos a 12.000 vezes G durante cinco minutos.

Realize uma segunda lavagem com água fria utilizando o aparelho robótico para a segunda carga de reação: coloque 12 equivalentes por amostra de nanopartícula de EDC na primeira bomba e 12 equivalentes por amostra de nanopartícula de NHS na segunda bomba. Inicie a plataforma robótica para dispensar volumes adequados nos tubos contendo as nanopartículas. A presença de EDC e NHS permitirá a formação de uma ligação amida entre os grupos amina do dietilenoglicol já ligado à superfície da nanopartícula e o grupo ácido carboxílico do açúcar com proteção profunda.

Após a conclusão da deposição, carregue 10 equivalentes de um sacarídeo específico. Neste caso, foi utilizado lactose e o controle de ácido glicólico nas duas bombas disponíveis. Cada sacarídeo é depositado em tubos de ensaio conforme a funcionalização desejada para cada tubo, previamente programada no programa de visão laboratorial, utilizado para operar os atuadores e as funções das bombas para a reação específica empregada. Neste estudo, para a ligação de carboidratos, o ácido glicólico é usado como controle de ligador, uma vez que sacarídeos profundamente protegidos já possuem esta molécula ligada covalentemente, o que permite a ligação adicional à superfície da nanopartícula.

As suspensões de nanopartículas são homogeneizadas por sonicação, como anteriormente, e então incubadas por nove horas com rotação constante a quatro graus Celsius. Após a incubação, lave as suspensões de nanopartículas por centrifugação, removendo o sobrenadante, em seguida ressuspenda o pellet em água fria e sonique. Coloque os tubos, que agora contêm a biblioteca de nanopartículas funcionalizadas, em uma câmara de vácuo para secagem por pelo menos duas horas. As nanopartículas funcionalizadas são caracterizadas por espalhamento dinâmico de luz e outros métodos para avaliar a composição da superfície, concentração, tamanho das partículas, distribuição de tamanho e carga superficial.

O lado diano totalmente protegido mostrado aqui foi sintetizado utilizando a plataforma automatizada. O composto sintetizado foi caracterizado por RMN de prótons em um espectrômetro VXR de 400 megahertz. Utilizando CDC13 como solvente, a formação do produto pode ser confirmada pela presença de alguns picos característicos.

No espectro de RMN de prótons, os quatro prótons entre 1,79 e 2,21 e os dois prótons em 3,38 são provenientes da etiqueta florista. O pico singlete em 2,16 corresponde ao pico do acetato; os picos em 4,94 e 5,11 são os prótons anômeros para avaliar o efeito do tempo de reação sobre a morfologia final das nanopartículas e o grau de ligação do açúcar obtido. As nanopartículas foram funcionalizadas com tempos crescentes de reação, conforme mostrado aqui, a concentração de diano na superfície das nanopartículas 50 50 CPT CPH aumentou com o tempo total de reação e atingiu um máximo após 18 horas.

Nanopartículas funcionalizadas com um tempo total de reação de 24 horas foram então utilizadas para avaliar sua capacidade de direcionar CLRs em células dendríticas derivadas de medula óssea de camundongo, utilizando citometria de fluxo, conforme mostrado aqui. Observou-se aumento na expressão do DC sign e do receptor mano para receptores tipo lectina C após estimulação com nanopartículas não funcionalizadas, bem como com nanopartículas funcionalizadas com lactose e dano. Isso indica um direcionamento eficaz.

No entanto, as partículas funcionalizadas com Diano mostraram um nível mais alto de expressão, indicando uma especificidade desse ligante pelos receptores que foram estudados. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar a síntese automatizada de alto rendimento de oligossacarídeos, bem como a funcionalização de nanopartículas poliméricas. Utilizando esses agentes de direcionamento baseados em carboidratos, uma vez dominada a síntese do açúcar protegido doador e aceitador, bem como a montagem do aparato, o processo pode ser concluído em 24 a 48 horas.

É claro que a duração depende do tamanho da biblioteca, bem como do tempo de funcionalização. Ao seguir este método, é importante lembrar que é possível otimizar as condições de reação da funcionalização de partículas poliméricas biodegradáveis dependendo da química da nanopartícula. Ao seguir este procedimento, diversas estruturas de carboidratos podem ser sintetizadas com o objetivo de direcionar-se a diferentes receptores celulares para influenciar o resultado imunológico.