Síntese combinatória de alta capacidade e liberação de proteínas a partir de polímero de Cinema e Bibliotecas Nanopartículas

Este vídeo descreve a síntese combinatória de bibliotecas de filmes e nanopartículas de polianidrido biodegradável e a detecção de alto rendimento da liberação de proteínas a partir dessas bibliotecas. Primeiro, um aparelho automatizado de deposição de alto rendimento é usado para depositar uma matriz com diversidade composicional de monômeros em cubetas de vidro. Uma reação de policondensação é realizada a 180 graus Celsius e 0,3 torr por 1,5 hora.

Essas condições de reação são específicas para a síntese do polímero anidrido poli C-P-H-S-A. Utilizando o aparelho de deposição automatizado, o solvente e quaisquer componentes para encapsulação são depositados nas cubetas contendo a biblioteca de polímeros. Pode-se aplicar sonicação para garantir a dissolução completa do polímero e a dispersão uniforme dos componentes adicionais.

Em seguida, o polímero dissolvido é transferido para um tubo contendo um antissolvente para fabricar a biblioteca de nanopartículas por nanoprecipitação. As nanopartículas são recuperadas por secagem a vácuo ou filtração e, em seguida, transferidas para uma placa modificada de 96 poços com liberação controlada. Por fim, a biblioteca carregada com proteína é incubada em condições fisiológicas e a cinética de liberação da proteína é avaliada utilizando um método de detecção fluorescente por espaçamento.

No final, podem ser obtidos resultados que mostram a cinética de liberação de proteínas em função das propriedades do polímero ou das condições do ambiente de liberação. A principal vantagem dessa abordagem em relação a outras técnicas convencionais de análise de uma amostra por vez é que somos capazes de sintetizar múltiplas amostras simultaneamente. Essas amostras podem então ser triadas em alto rendimento quanto às interações proteína-polímero, célula-polímero ou polímero-hospedeiro.

Isso então acelera o projeto e desenvolvimento racionais desses biomateriais para liberação de fármacos e engenharia de tecidos. A demonstração do procedimento será feita por La Tricia Peterson, uma pós-operatória do meu laboratório. Nesta seção do vídeo, um aparelho de deposição de alto rendimento Hyatt é utilizado para depositar uma biblioteca de monômeros com variação composicional após a síntese do polímero.

Este aparelho é utilizado para fabricar uma biblioteca combinatória de filmes poliméricos ou nanopartículas vazios ou carregados com proteínas. A plataforma automatizada consiste em duas bombas de seringa programáveis e três atuadores lineares conectados em série a um computador. O software LabVIEW é usado para enviar comandos às bombas de seringa e aos atuadores.

Seringas gast tight de 10 cc são carregadas nas bombas de seringa com tubos capilares de metal conectados por encaixes tipo lure lock, que dispensam as soluções poliméricas em cubetas de vidro. Nesta demonstração, ácido seícico ou SA será usado com um seis Biss para oxi heano ou CPH para produzir uma biblioteca de nanopartículas encapsulando albumina sérica de bovino marcada com Texas Red. As instruções deste vídeo e dos documentos complementares podem ser adaptadas para fabricar e testar uma ampla variedade de bibliotecas de filmes poliméricos e nanopartículas.

Para sintetizar as bibliotecas, comece dissolvendo cada monômero e clorofórmio em uma concentração final de 25 miligramas por mililitro em um frasco de vidro. Em seguida, carregue cada solução em uma seringa gastight de 10 cc aspirando a solução pela extremidade com trava do tipo lure lock da seringa. Remova todas as bolhas de ar.

Em seguida, acople o tubo capilar de aço inoxidável com trava resistente ao solvente à extremidade da seringa. Prenda os tubos capilares em grampos e fixe-os a um suporte com haste. Em seguida, posicione as extremidades de ambos os tubos capilares dentro do vete inicial.

Para a deposição do monômero. Coloque as seringas nas bombas de seringa programáveis e fixe-as na posição no software de visualização do laboratório. Defina os atuadores lineares na posição inicial no software.

Inicie a deposição automatizada dos monômeros de SA e CPH em cubetas de vidro ao longo dos eixos x, y e Z. Atuadores posicionarão corretamente os tubos capilares em cada Q, e bombas injetarão volumes programados de cada monômero, criando uma biblioteca de monômeros com composição variável. Após a deposição dos monômeros.

Transfira a biblioteca de monômeros para uma estufa a vácuo pré-aquecida e incube a 180 graus Celsius e 0,3 torr por 1,5 hora para permitir a polimerização por condensação. Após a incubação, a fabricação da biblioteca de polímeros é concluída. Em seguida, são geradas nanopartículas poliméricas carregadas com proteína.

Consulte o protocolo complementar para a fabricação de uma biblioteca de filmes poliméricos carregados com proteína para a produção de uma biblioteca de nanopartículas carregadas com proteína. Adicione a proteína, neste caso, albúmina sérica bovina marcada com Texas red, ao solvente apropriado, que deve ser capaz de dissolver a biblioteca polimérica. Neste caso, utiliza-se diclorometano numa concentração de dois miligramas por mililitro.

Encha a seringa de 10 cc com o solvente contendo BSA marcado com Texas Red e coloque-a na primeira bomba de seringa. Em seguida, coloque uma seringa limpa e vazia de dois cc na segunda bomba de seringa e posicione os tubos contendo 15 mililitros de um não solvente, neste caso pentano, no suporte de tubos adjacente à plataforma de frascos. A seguir, no laboratório, no software, inicie o processo automatizado de deposição de solvente selecionando o programa.

Após o início do programa, o solvente é depositado nas cubetas contendo a biblioteca de polímeros, resultando em uma concentração de polímero de 20 miligramas por mililitro. Quando todo o solvente tiver sido depositado, deixe-o dissolver o polímero por um a cinco minutos. Em seguida, realize uma etapa opcional de homogeneização para garantir a completa dissolução do polímero e uma dispersão uniforme da proteína.

Em seguida, inicie o programa de transferência de amostra no LabVIEW. Cada amostra de polímero dissolvido na biblioteca é então aspirada para dentro da seringa vazia e dispensada no tubo correspondente contendo o não solvente no porta-amostras. Após a transferência de cada amostra, recupere as nanopartículas carregadas com proteína colocando a biblioteca de nanopartículas em uma câmara de vácuo a 10 milímetros de mercúrio de vácuo, ou utilizando filtração a vácuo até a remoção do solvente.

Para investigar a liberação da BSA encapsulada, comece com uma placa de polipropileno de 96 poços profundos que tenha sido modificada pela remoção da metade superior de cada parede do poço em cada coluna adjacente alternada na placa. A remoção da parte superior de cada poço entre as colunas A e B, C e D, E e F, G e H permite o fluxo de líquido entre cada par de poços adjacentes quando preenchidos até o volume total de transferência. Adicione padrões de BSA marcada com Texas Red variando de 1000 a 10 microgramas por mililitro na placa de 96 poços profundos.

Estes serão utilizados para calcular a quantidade de proteína e também levarão em consideração o quenching do fluorocromo. Reconstitua a massa desejada de nanopartículas em tampão PBS, em seguida sonique para dispersar uniformemente as partículas. Em seguida, transfira a biblioteca de nanopartículas para a placa de 96 poços profunda e aguarde até que as amostras sedimentem no fundo da placa. Depois, utilizando uma pipeta, encha lentamente todos os poços adjacentes com tampão PBS até um quarto de polegada da borda superior do poço.

Deve haver quantidade suficiente de tampão nos poços adjacentes para que ele flua livremente entre os poços. Em seguida, feche a placa de liberação com a tampa e coloque-a a 37 graus Celsius sob agitação. Durante todo o experimento, em intervalos de tempo progressivos, utilize um scanner fluorescente plano Typhoon 9.400 para escanear a placa usando os filtros apropriados de excitação, laser e emissão.

Após a leitura, utilize um software de quantificação de imagem para quantificar a quantidade de proteína conjugada ao fluorocromo liberada em cada tempo. Neste caso, a BSA marcada com Texas Red foi encapsulada em uma biblioteca de nanopartículas poliméricas sintetizadas a partir dos monômeros SA e CPH, conforme descrito neste vídeo, para determinar a cinética de liberação da proteína em função da química do polímero. As nanopartículas carregadas com proteína foram incubadas a 37 graus Celsius durante um mês, período no qual foram obtidas leituras fluorescentes em pontos temporais incrementais para quantificação da liberação da proteína.

Como mostrado aqui, este método de alto rendimento foi utilizado para determinar a cinética de liberação da BSA marcada com Texas Red a partir de uma biblioteca de nanopartículas de polianidrido A-C-P-H-S-A. Foram observadas tendências dependentes da composição química, com aumento nas taxas de liberação a partir das químicas de filme de Sarich. Resultados semelhantes foram obtidos ao utilizar ensaios padrão de quantificação de proteínas.

Em um experimento separado, a liberação da BSA marcada com Texas Red a partir de bibliotecas de filmes de polianidrido CPH-CPT foi avaliada, conforme mostrado aqui, sendo observadas cinéticas de liberação próximas à ordem zero, com os filmes ricos em cpeg liberando a proteína mais rapidamente, apresentando potenciais aplicações no campo médico como dispositivos biodegradáveis de liberação de fármacos. Esses resultados indicam que o perfil de liberação desejado de um fármaco terapêutico ou antígeno vacinal pode ser controlado pela alteração da química do polímero. Após este procedimento, outros métodos combinatórios foram desenvolvidos para investigar áreas como estabilidade proteica, toxicidade celular, ativação celular e biodistribuição InVivo.

Esses aspectos são importantes para o projeto racional de biomateriais para liberação de fármacos e engenharia de tecidos. Não se esqueça de usar EPIs adequados e praticar procedimentos laboratoriais seguros durante todo este protocolo.