Vídeo oculografia-in Mice
19 de julho de 2012
Vídeo oculografia é um método muito quantitativa para investigar o desempenho do motor ocular, bem como a aprendizagem motora. Aqui, nós descrevemos como medir vídeo-oculografia em camundongos. Aplicando esta técnica em normal, farmacologicamente-tratados ou camundongos geneticamente modificados é uma poderosa ferramenta de pesquisa para explorar a fisiologia subjacente de comportamentos motores.
O objetivo geral deste procedimento é realizar a videooculografia em camundongos. Isso é realizado primeiramente equipando o camundongo com uma construção de pedestal em seu crânio, o que permite a imobilização de sua cabeça em um restritor especial de cabeça e corpo. O segundo passo é posicionar o camundongo no equipamento de videooculografia e calibrar o sistema de rastreamento pupilar por vídeo.
Em seguida, os movimentos oculares são registrados enquanto o sistema oculomotor é ativado usando um amplo repertório de estímulos vestibulares e optocinéticos. O passo final consiste em analisar esses movimentos oculares. Em última instância, a videonistagmografia em camundongos normais, tratados farmacologicamente ou modificados geneticamente pode ser utilizada para explorar a fisiologia dos comportamentos motores.
Embora este método possa fornecer informações sobre o sistema motor ocular, ele também pode ser aplicado para estudar doenças de origem cerebelar, vestibular ou ocular utilizando mutantes de camundongo que mimetizam patologias humanas. Para iniciar este procedimento, anestesie o camundongo em uma câmara de gás com uma mistura de isof, flúor e oxigênio. Em seguida, mantenha a anestesia administrando o gás por meio de uma máscara.
Em seguida, utilize uma bolsa térmica e um sensor anal de termometria para manter a temperatura corporal do camundongo a 37 graus Celsius. Posteriormente, aplique o unguento ocular para proteger os olhos contra ressecamento, raspe os pelos cranianos dorsais e limpe a área cirúrgica. Depois disso, faça uma incisão mediana para expor a superfície craniana dorsal do crânio, limpe e seque a superfície.
Em seguida, aplique uma gota de ácido fosfórico do bgma ao Lambda. Após 15 segundos, remova a corrosão, depois limpe a superfície craniana com solução salina e seque-a novamente. Aplique uma gota de opti bond prime sobre a superfície craniana corroída e ao ar.
Seque por 30 segundos. Em seguida, adicione uma gota de adesivo opti bond sobre o primer opti bond. Polimerize com luz UV por um minuto.
Depois disso, cubra a camada adesiva com uma camada fina de compósito charisma. O conector com orifício para parafuso imantado e os locais de fixação são embutidos no compósito. Em seguida, cure o compósito com luz UV.
Novamente, se necessário, aplique camadas adicionais de compósito e polimerize-as com luz. Deixe o camundongo se recuperar por pelo menos três dias após a cirurgia. O próximo passo é colocar o camundongo no restritor e fixar sua cabeça ao restritor com o ímã e um parafuso, montando o restritor de cabeça e corpo do camundongo em uma plataforma XY.
Usando a plataforma XY, posicione a cabeça do camundongo acima do centro do giroscópio para que o animal possa ser movido sobre os eixos de arfagem Ya e rolagem. Em seguida, posicione a cabeça na inclinação ya e no ângulo de rolagem corretos, alinhando o olho com base na imagem visual do olho gerada pelo sistema de varredura ocular. Agora, o giroscópio está conectado a um motor controlado por servoalternado (CA).
A posição do plato giratório é monitorada com um potenciômetro acoplado ao eixo do plato. O plato é coberto por uma tela cilíndrica circundante com um padrão aleatório de pontos, que também é equipada com um motor controlado por servo-AC. A posição da tela cilíndrica é monitorada por um potenciômetro acoplado ao seu eixo.
A tela pode ser iluminada por uma luz de halogênio. O movimento do plato giratório e da tela ao seu redor é controlado por um computador conectado a uma interface de entrada e saída. Os sinais de posição do plato giratório e da tela ao seu redor são filtrados por uma frequência de corte de 20 hertz, digitalizados pela interface de entrada e saída e armazenados neste computador.
O olho do camundongo é iluminado por três emissores de infravermelho. Dois estão fixos no prato giratório, e o terceiro está acoplado à câmera. Este terceiro emissor produz uma reflexão corneana de referência, que é utilizada durante o procedimento de calibração e durante as gravações dos movimentos oculares.
Uma câmera CCD de infravermelho equipada com lente de zoom é acoplada ao giroscópio e focalizada na cabeça do camundongo. No centro do giroscópio. A câmera pode ser destravada e movida ao redor do eixo do giroscópio em exatos 20 graus.
Durante o procedimento de calibração, o sinal de vídeo é então processado por um sistema de rastreamento ocular, que pode rastrear a pupila e a reflexão corneana de referência nas direções horizontal e vertical a uma taxa de amostragem de 120 hertz. Em seguida, a posição de referência corneana, a posição da pupila e os sinais de tamanho da pupila são digitalizados pela interface de entrada e saída e armazenados no mesmo arquivo que os sinais de posição da mesa e da tela ao redor, para calibrar os movimentos oculares. Ajuste a posição da cabeça do camundongo com a câmera de modo que a imagem em vídeo da pupila esteja situada no centro do monitor e a representação da referência corneana esteja localizada na linha média vertical do olho, diretamente acima da pupila.
Em seguida, mova a câmera várias vezes em 20 graus de pico. Realize o pico ao redor do eixo vertical da plataforma giratória. Utilize as posições da pupila rastreada e da referência corneana registradas nas posições extremas da câmera para calcular o raio da rotação da pupila.
Repita esses passos várias vezes sob diversas condições de iluminação para determinar a relação entre o tamanho da pupila e a rotação da pupila. Em seguida, elabore uma curva de correção da rotação da pupila. Agora, calcule a posição angular do olho medindo a posição de referência da córnea, a posição da pupila e o tamanho da pupila.
O valor da rotação da pupila pode ser extraído da curva de correção da rotação da pupila, e a posição angular do olho pode ser calculada utilizando a seguinte fórmula. Aqui é demonstrado o experimento de movimento ocular VVOR. Agora, converta as posições oculares, posições da mesa e posições da tela ao redor em posições angulares.
Em seguida, diferencie e filtre as posições angulares da mesa do olho e da tela circundante com um filtro passa-baixa Butterworth. Utilizando uma frequência de corte de 20 hertz sub, remova o segundo do sinal de velocidade ocular usando um limiar de detecção de 40 graus por segundo. Em seguida, média os sinais de velocidade da mesa e do olho utilizando cada ciclo individual do ensaio e ajuste os sinais médios com uma função apropriada.
Em geral, utiliza-se uma estimulação de velocidade senoidal e os ciclos médios são ajustados com uma função seno ou cosseno. Este vídeo mostra como os movimentos oculares são gerados pela rotação da tela ao redor, provocando o reflexo optocinético com a rotação da tela ao redor em uma faixa de frequência de 0,2 a um hertz com uma amplitude de 1,6 graus. O sistema optocinético do camundongo mostra-se mais eficiente na faixa de baixa frequência do que na faixa de alta frequência.
Aqui está outro vídeo para mostrar como os movimentos oculares são gerados. Ao girar o mouse no escuro para provocar o reflexo vestibulo-ocular, rotacionando o prato giratório em uma faixa de frequência de 0,2 a um hertz com uma amplitude de 1,6 graus. O sistema vestibulo-ocular do mouse demonstra ser mais eficiente na faixa de alta frequência do que na faixa de baixa frequência.
Aqui é mostrado outro vídeo sobre como os movimentos oculares são gerados ao rotacionar o mouse na luz para provocar o reflexo vestibulococular visualmente aprimorado, rotacionando o prato giratório em uma faixa de frequência de 0,2 a um hertz com uma amplitude de 1,6 graus, enquanto a tela ao redor está bem iluminada, demonstrando que o mouse gera movimentos oculares compensatórios eficientes em toda a faixa de frequência. E este vídeo mostra como a aprendizagem motora foi realizada por meio do aumento adaptativo do reflexo vestibulococular. Utilizando um paradigma de treinamento fora de fase, rotacionar o prato giratório fora de fase em relação à tela ao redor aumenta o ganho do RVO deste mouse.
Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar um exame oculovídeo em camundongos.
Visão Geral
Este artigo descreve o procedimento para realizar video-oculografia em camundongos, um método quantitativo para investigar o desempenho motor ocular e a aprendizagem motora. A técnica pode ser aplicada a camundongos normais, tratados farmacologicamente ou geneticamente modificados para explorar a fisiologia dos comportamentos motores.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Desempenho Motor Ocular
- Apredizagem Motora
Antecedentes
- A vídeoolcografia é um método utilizado para estudar os movimentos oculares.
- Essa técnica fornece informações sobre o sistema oculomotor.
- Ela também pode ser utilizada para estudar doenças de origem cerebelar ou vestibular.
- Modelos em camundongos podem simular patologias humanas para fins de pesquisa.
Objetivo do Estudo
- Medir e analisar os movimentos oculares em camundongos.
- Investigar a fisiologia subjacente aos comportamentos motores.
- Aplicar o método a diversos modelos de camundongos para estudos de doenças.
Métodos Utilizados
- Equipar o camundongo com um pedestal para imobilização da cabeça.
- Calibrar o sistema de rastreamento do pupilo por vídeo.
- Registrar os movimentos oculares utilizando estímulos vestibulares e ópticos.
- Analisar os movimentos oculares registrados para obter insights fisiológicos.
Resultados Principais
- Calibração bem-sucedida do sistema de rastreamento ocular.
- Gravação dos movimentos oculares sob diversas condições de estímulo.
- Análise de dados revelando insights sobre a fisiologia do comportamento motor.
- Aplicação do método para o estudo de doenças do sistema motor ocular.
Conclusões
- A video-oculografia é uma ferramenta poderosa para o estudo dos movimentos oculares.
- O método pode aprimorar a compreensão da aprendizagem motora e do desempenho.
- Tem potencial para investigar doenças que afetam o sistema oculomotor.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A vídeoolcografia em camundongos fornece um indicador comportamental quantitativo para avaliar a função oculomotora, permitindo a redução de riscos mecanicistas de alvos envolvidos nas vias vestibular, cerebelar e motora ocular. O método apoia a validação de alvos ao associar manipulações genéticas ou farmacológicas a alterações mensuráveis nos movimentos reflexos dos olhos, oferecendo confiança preditiva no estágio inicial de descoberta. Sua aplicabilidade a modelos relevantes para doenças potencializa a continuidade translacional em pipelines de transtornos neuropsiquiátricos e neurodegenerativos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas direcionadas aos sistemas vestibular, cerebelar e oculomotor por meio de fenótipos comportamentais quantificáveis.
- Valor Operacional: Oferece um ensaio reprodutível e compatível com alta produtividade para triagem de modificadores genéticos e farmacológicos do comportamento motor.
- Valor Científico: Apoia a desmistificação biológica ao isolar a função do circuito oculomotor de variáveis motoras ou motivacionais confundentes.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera medidas quantitativas de variáveis dependentes (velocidade ocular, ganho, fase) que permitem a correlação entre dose-resposta e genótipo-fenótipo.
- Valor Operacional: Protocolos padronizados de calibração e rastreamento garantem reprodutibilidade entre laboratórios e prontidão do ensaio para avaliação de compostos.
- Valor Científico: Os resultados permitem redução de riscos mecanicistas ao distinguir as contribuições vestibular, optocinética e do VOR potencializado visualmente para o controle motor.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Sistema relevante para doenças: modelos de camundongos que imitam patologias vestibulares, cerebelares ou oculares humanas permitem o alinhamento direto de biomarcadores translacionais.
- Valor Operacional: Permite o acompanhamento longitudinal da aprendizagem motora e da plasticidade adaptativa, apoiando a validação pré-clínica de terapêuticas cognitivas e motoras.
- Valor Científico: Facilita decisões de avanço com ajuste de risco ao quantificar a recuperação funcional ou a progressão de déficits em modelos genéticos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra aos fluxos de trabalho iniciais de descoberta como uma ferramenta de triagem fenotípica para validação de alvos, cujos resultados orientam a identificação de compostos líderes e decisões de avanço pré-clínico com base na integridade do sistema oculomotor.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias ao isolar as contribuições vestibular e optocinética no controle dos movimentos oculares.
- Triagem: Oferece prontidão para ensaios por meio da fixação padronizada da cabeça, calibração e apresentação de estímulos, permitindo avaliação confiável de compostos ou genótipos.
- Análises: Fornece parâmetros quantitativos (posição angular do olho, velocidade, ganho) filtrados e ajustados a estímulos sinusoidais para análise comparativa entre diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica por meio da aplicabilidade em modelos de doenças, permitindo a avaliação do impacto terapêutico sobre fenótipos de comportamento motor.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma plataforma reutilizável para equipes multifuncionais que estudam aprendizado motor, distúrbios do equilíbrio e indicações neuropsiquiátricas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva no engajamento do alvo por meio de alterações mensuráveis no ganho e na fase do RVO, ROK e RVOV.
- Valor Operacional: O preparo cirúrgico padronizado, a imobilização da cabeça e o rastreamento por infravermelho garantem reprodutibilidade entre laboratórios e pontos temporais.
- Valor Estratégico: Reduz o risco biológico em estágios avançados ao permitir a detecção precoce de disfunção no circuito motor em modelos genéticos ou farmacológicos.
- Impacto no Portfólio: Orienta decisões de avançar/não avançar ao quantificar o desempenho oculomotor como biomarcador da integridade do circuito neural.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em cirurgia de camundongos, implante de placas cranianas e sistemas de rastreamento oculomotor por infravermelho.
- Depende de equipamentos especializados, incluindo plataformas XY, giroscópios controlados por servomecanismo, emissores de infravermelho e câmeras CCD de alta velocidade.
- Necessita padronização entre equipes dos protocolos cirúrgicos, procedimentos de calibração e parâmetros de estímulo para resultados reprodutíveis.
- As considerações de adaptação incluem ajustes específicos ao modelo quanto à linhagem do camundongo, peso e pigmentação ocular, que afetam a precisão do rastreamento por infravermelho.
- As limitações práticas incluem o tempo de recuperação pós-cirúrgico e possíveis interferências decorrentes da anestesia ou inflamação que afetam a função oculomotora basal.
