Reação em Cadeia da Polimerase: Protocolo Basic Plus Estratégias de solução de problemas e otimização

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar as etapas envolvidas na reação em cadeia da polimerase, ou PCR, que é utilizada para produzir uma quantidade abundante de um segmento específico de DNA a partir de uma pequena quantidade de material inicial. Primeiro, reúna os reagentes e materiais a serem utilizados na reação de PCR, em seguida prepare a mistura de reação, incluindo os quatro desoxirribonucleotídeos, o molde de DNA, os iniciadores e a DNA polimerase. Depois, programe as condições de ciclagem térmica e execute a reação de PCR.

Após isso, verifique os resultados para determinar se a reação foi bem-sucedida. Em última análise, uma reação em cadeia da polimerase deve gerar um amplicon específico com o tamanho desejado do produto.

Em geral, indivíduos novos neste protocolo terão alguma dificuldade ao configurar os cálculos de cada um dos reagentes variáveis e, às vezes, terão problemas com a pipetagem e os volumes corretos, especialmente com a polimerase, que contém glicerol. Inicie o experimento com um balde de gelo recém-abastecido. Use luvas para evitar contaminar a reação.

Mistura e reagentes. Organize os componentes da PCR no gelo para descongelar completamente. Estes incluem o molde de DNA, os iniciadores, a polimerase do DNA, tampão de reação 10 x com ou sem cloreto de magnésio, desoxinucleotídeos, água estéril e cloreto de magnésio.

O cloreto de magnésio é necessário se utilizar o tampão sem cloreto de magnésio. Coloque uma placa de 96 poços em um recipiente com gelo como suporte para os tubos PCR de parede fina de 0,2 mililitro. Agora, organize a bancada com tubos PCR e tampas.

Um suporte para tubos de PCR, uma caneta resistente ao etanol e um conjunto de micropipetas. Sempre crie uma tabela de reagentes detalhando a mistura da reação com água destilada estéril em quantidade suficiente para obter um volume final de 50 microlitros. Por exemplo, utilizando cinco microlitros de um tampão sem magnésio, um microlitro de NTPs de DNA a 10 milimolares e magnésio otimizado a 4,0 milimolar.

Um microlitro de cada iniciador a vinte micromolar, 0,5 microlitros de um molde a dois nanogramas por microlitro e 0,5 microlitros de polimerase exigiriam apenas 33 microlitros de água estéril. Adicione cloreto de magnésio se ele não estiver presente no tampão 10 x ou se necessário para a otimização da PCR.

Prossiga para rotular os tubos de PCR com uma caneta resistente ao etanol, colocando um rótulo em cada tubo de reação. Primeiro, adicione as quantidades calculadas de água estéril, em seguida adicione o tampão 10 x e os dNTPs a 10 milimolares. Para esta reação, estamos realizando uma titulação com cloreto de magnésio.

Como a concentração de magnésio não será constante, o cloreto de magnésio é adicionado individualmente aos tubos de PCR, e o volume é normalizado para 10 microlitros com água estéril, de modo que 40 microlitros da mistura mestra final sejam adicionados a cada tubo de PCR. Para completar a reação de 50 microlitros com o cloreto de magnésio, continue adicionando o molde de DNA e os iniciadores. Por fim, adicione 0,5 a 2,5 unidades de DNA polimerase por reação de 50 microlitros em um tubo microfuga de 1,8 mililitro.

Prepare uma solução de mistura mestra suficiente para acomodar os controles, bem como perdas por transferência com a pipeta. Ajuste uma micropipeta para cerca de metade do volume total da solução e misture suavemente por pipetagem. Para cada amostra de teste, adicione a mistura mestra ao tubo de PCR.

Agora, para o controle negativo sem DNA molde, adicione todos os reagentes e use água estéril para compensar o volume de DNA ausente. Em seguida, para o controle positivo, utilize um conjunto de DNA molde e iniciadores que amplifiquem um fragmento conhecido nas mesmas condições dos exemplos experimentais de PCR. Os termocicladores de PCR aquecem e resfriam rapidamente a mistura de reação, permitindo a desnaturação induzida pelo calor de duplex, o emparelhamento dos iniciadores às fitas positiva e negativa do molde de DNA e a alongamento do produto de PCR.

Os tempos de ciclagem baseiam-se no tamanho do molde e no teor de GC do DNA para a fórmula geral. Inicie com uma desnaturação inicial do molde, seguida pela realização de 25 a 35 ciclos de um programa de ciclo de temperatura em três etapas. A primeira etapa desses ciclos desnatura o molde de DNA.

Em seguida, programe uma temperatura ideal de anelamento das sondas cerca de cinco graus Celsius abaixo da temperatura aparente de fusão das sondas, seguida pela etapa de alongamento para levar a polimerase ao molde de DNA e sintetizar o produto da PCR. Agora, insira o número de ciclos. Próximo programa.

Uma etapa prolongada de alongamento para conclusão da síntese dos amplicons. Por fim, inclua uma etapa de terminação, resfriando a mistura até quatro graus Celsius. Se as condições-padrão de PCR não produzirem o amplicon desejado, é necessário otimizar a PCR para obter melhores resultados.

Portanto, se as reações não funcionaram da primeira vez, você deve tentar identificar o problema na reação. Primeiramente, é importante garantir que o problema não tenha sido um erro humano. Isso pode ocorrer se houver um erro de pipetagem ou se você se esquecer de adicionar um reagente ao teste, a um dos tubos de ensaio.

Em seguida, você pode tentar alterar algumas das stringências da condição, ajustando a configuração do termociclador, ou pode modificar a concentração de magnésio, que é outro método alternativo. Também é possível tentar adicionar alguns aditivos ao reagente para solucionar os problemas. Alternativamente, considere a PCR com início quente como uma modificação versátil, na qual o tempo de desnaturação inicial é aumentado significativamente.

A eletroforese em gel AROS é então utilizada para separar o PCR do gene GAL três a partir do DNA genômico de S. seia, a fim de determinar a concentração ótima de íons magnésio para este conjunto de reagentes. Observe que um produto de PCR do tamanho esperado — 2098 pares de bases — aparece a partir de uma concentração de magnésio de 2,5 milimolar, com concentração ótima em 4 milimolar. Em diferentes modelos de DNA, a amplificação do produto de PCR desejado como uma banda distinta requer 2 milimolar de magnésio. A redução da especificidade da reação, levando a condições de amplificação efetivamente subótimas, produz um borramento de produtos inespecíficos.

Além disso, com o aumento geral da rigidez da reação, é necessário uma quantidade menor de íon magnésio para formar um ícone de amplicon. Assim, a otimização da PCR, atentando-se às variáveis, pode produzir o produto desejado de forma específica. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como montar e preparar uma reação em cadeia da polimerase.

O objetivo é compreender as variáveis de cada PCR e como elas podem ser manipuladas para gerar o amplicon desejado.