Personalização da Aspergillus niger Morfologia através da adição de partículas de talco Micro

Este método gera e caracteriza estruturas morfológicas dependentes de micropartículas de fungos filamentosos, *Aspergillus niger*, para correlacionar a morfologia fúngica com a produtividade. Cultive *A. niger* com ou sem micropartículas em um biorreator agitado de três litros por 72 horas para calcular a produtividade específica. Colete amostras em pontos de tempo definidos e determine a biomassa, o peso seco e a atividade da vetifrutosase.

Após 72 horas, examine a morfologia fúngica por microscopia e caracterize-a por meio de análise de imagem digital. Em seguida, combine parâmetros relevantes da análise de imagem em um número de morfologia que é matematicamente correlacionado com a produtividade específica. Em última instância, este método pode gerar com precisão e caracterizar de forma abrangente a morfologia do Aspergillus niger para uma melhor compreensão da morfogênese de microrganismos filamentosos.

Aspergillus niger é uma importante cepa industrial na biotecnologia há várias décadas. Uma das características mais intrigantes e muitas vezes incontroláveis dos aspergillus, niger e espécies relacionadas é a morfologia complexa, que varia de pelotas esféricas densas a micélios viscosos, dependendo das condições de cultivo. A principal vantagem do nosso procedimento é que, com a adição de micropartículas, agora é possível adaptar a morfologia fúngica especificamente às necessidades do processo.

Até o momento, nenhum outro método foi descrito para essa personalização da morfologia fúngica. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais sobre o cultivo de micro-organismos filamentosos. Pois, para aplicação industrial, é crucial controlar a morfologia fúngica e também distinguir entre uma morfologia fúngica bem produtiva e outra pouco produtiva.

Nosso protocolo fornece os meios para personalização e caracterização desejáveis da morfologia fúngica. Embora este método possa fornecer informações sobre a morfologia de Aspergillus niger, ele também pode ser aplicado a outros microrganismos filamentosos, como cepas de Penicillium ou Strepto. Prepare quatro biorreatores para culturas estéreis conforme detalhado no protocolo complementar.

Texto baseado na adição de micropartículas, cultive Aspergillus niger com diferentes morfologias. Após 72 horas, transfira 50 mililitros de amostras do caldo de cultura para um tubo Falcon.

As amostras de biomassa devem ser coletadas pelo menos em duplicata após a secagem no dessecador; pese um filtro de celulose com as microbalanças. Coloque o filtro em um funil de Büchner com bomba de vácuo de jato de água conectada, filtre 10 mililitros da amostra seguidos por 10 mililitros de água desionizada para remover os compostos do meio da biomassa; dobre o filtro uma vez ao meio.

Coloque-o em uma placa de Petri de vidro e em uma estufa com compartimentos até constância de peso. Transfira o filtro para um dessecador e deixe esfriar. Em seguida, meça o peso.

Calcule o peso seco da biomassa por litro mediante o cálculo do peso, diferença dos filtros e subsequente divisão pelo volume da amostra para os ensaios enzimáticos de glicose oxidase e peroxidase. Armazene as amostras em gelo utilizando uma seringa, 1,5 mililitros. Passe a suspensão de cultura através de um filtro de acetato de celulose em um tubo de reação para realizar o ensaio beta fructo SASE.

Com rigor, garantimos o sucesso utilizando duas amostras em triplicata para robustez estatística. Para iniciar o ensaio, adicione 20 microlitros da amostra ao tubo de ensaio; para controle da clivagem dependente de pH e temperatura da sacarose em glicose, utilize 20 microlitros de água desionizada em vez de 20 microlitros da amostra. Além disso, para cada amostra, prepare um controle negativo para detecção de glicose residual no caldo de cultura por meio do ensaio.

20 microlitros de amostra inativada pelo calor. Para iniciar a reação da sacarose em glicose, adicione 200 microlitros de solução de sacarose 1,65 molar. Em pH 5,4, adicione 20 microlitros de amostra e incube todos os tubos de reação em um bloco aquecedor a 40 graus Celsius por 20 minutos. Interrompa a reação aquecendo a 95 graus Celsius por 10 minutos após resfriar os tubos em gelo.

Centrifugue as amostras quando necessário, dilua as amostras para o ensaio de modo que a absorção medida esteja dentro da faixa de valores calibrados. Agora, para cada reação, adicione dois microlitros de amostra em uma placa de microtitulação. Realize as medições das amostras em triplicata.

Prepare também uma curva padrão para 10 soluções de glicose variando de um milimolar a 15 milimolar. Para a calibração do ponto zero, use dois microlitros de água desionizada. Em seguida, adicione 200 microlitros da solução reagente a cada uma.

Incube bem por 10 minutos à temperatura ambiente. Meça a absorção em 450 nanômetros utilizando um leitor de microplacas Sunrise de 96 poços e o software de recuperação de dados Magellan. Abra o gráfico de resultados com uma planilha e construa uma linha de calibração de curva padrão.

Calcule a atividade para cada amostra. Em seguida, compute a atividade da beta-frutofrase subtraindo os valores do controle negativo apropriado da atividade da amostra. Por fim, calcule a produtividade específica levando em consideração o peso seco da biomassa e a atividade da beta-frutofrase.

Coloque três mililitros de suspensão de cultura em uma placa de Petri de plástico e dilua com solução fisiológica de cloreto de sódio para separar as estruturas morfológicas. A qualidade das imagens microscópicas é de importância excepcional. Para a análise subsequente das imagens, deve-se ter cuidado durante a etapa de diluição.

Posicione a placa de Petri sob um microscópio com câmera integrada. Adquira e salve cerca de 100 imagens de estruturas morfológicas por amostra, garantindo que pelo menos um objeto esteja completamente representado em cada imagem. Prossiga da mesma maneira com placas contendo amostras de reatores diferentes, adquirindo novas imagens a cada vez.

Observe a forma de crescimento morfológico diferente de amostras provenientes de reatores distintos cultivados com quantidades variadas de pó de talco adicionado. Em seguida, abra todas as imagens da mesma amostra no programa de processamento de imagens Image J. Utilizando a ferramenta de processo, torne-as binárias.

Converta as imagens em preto e branco para aplicar o comando a uma série inteira de imagens. Em seguida, utilize um código macro, abra uma das imagens que contenha uma barra de escala. Trace uma linha reta sobre a barra de escala para determinar o número de pixels correspondentes a 2000 mícrons.

Selecione a ferramenta de análise, defina a medição e escolha os fatores de forma, ferrets, diâmetro da área e perímetro. Utilize um código macro para processar uma série de imagens. Agora abra a planilha que apresenta os resultados dos valores do fator de forma.

Para cada imagem, calcule um número de morfologia para cada imagem com todas as imagens de uma amostra. Calcule o valor médio do número de morfologia. Utilize um programa de criação de gráficos e análise de dados para plotar o número de morfologia em função da produtividade específica.

Determine a relação matemática por regressão matemática mediante a adição de concentrações crescentes de micropartículas de talco. Oito Niger SKAN 10 15. A morfologia é alterada de uma morfologia de pelota verdadeira para uma morfologia dispersa ou mesmo mielóide, já que a morfologia de pelota esperada é exibida em condições padrão.

Curiosamente, a morfologia micelial é criada pela suplementação do meio com 10 gramas por litro de micropartículas de talco. Concomitantemente, a atividade da beto fruto tase aumenta aproximadamente três vezes; a suplementação com um ou três gramas por litro de pó de talco leva a uma morfologia dispersa com atividade de frutose duplicada, utilizando parâmetros determinados por análise automática de imagens. A morfologia dependente de micropartículas pode ser descrita de forma abrangente pela morfologia.

Observa-se que partículas com formato arredondado e perfeitamente circulares em pellets lisos aparecerão como círculos perfeitos em imagens microscópicas. O número de morfologia apresenta um valor próximo a um nas condições padrão. A morfologia no reator um exibe um número de morfologia em torno de 0,8.

A morfologia no reator quatro com 10 gramas por litro. O pó de talco apresenta um número de morfologia em torno de 0,1. O número de morfologia para os reatores dois e três, com concentrações de pó de talco de um e três gramas por litro, situa-se entre esses extremos, demonstrando uma morfologia dispersa.

Como a morfologia dependente de micropartículas está estreitamente relacionada com a produtividade das beta frutocíticas, existe uma boa correlação matemática entre morfologia, número e produtividade após o seu desenvolvimento. Esta técnica abriu caminho para que pesquisadores na área de biotecnologia explorassem mais a fundo a morfologia fúngica e, especialmente, sua relação com a produtividade. Após este procedimento de criação detalhada de tipos cruzados morfológicos específicos de fungos, outros aspectos importantes do cultivo de microrganismos filamentosos podem ser explorados.

A morfologia micelial, por exemplo, é conhecida por ser muito mais viscosa do que a morfologia em palheta. Portanto, a produtividade geral do processo é prejudicada por problemas e pela purificação do produto desejado. Nosso número de morfologia ajudará a estabelecer modelos relacionados ao cultivo, à pro-teologia e a aprofundar nossa compreensão da morfologia fúngica em geral.