Usando Seqüência de Detenção SECM como uma ferramenta para isolar Ribossomos Polipeptídeos encadernados

O objetivo geral deste procedimento é isolar complexos de ribossomos ligados a cadeias nascentes, ou RNCs, associados ao SEC TED 70 s produzidos durante a tradução em um sistema livre de células in vitro. Isso é realizado primeiramente introduzindo uma sequência de estagnação do SEC M com 17 aminoácidos no extremo C-terminal do gene de interesse e clonando-a a jusante do promotor transcricional T sete. Em seguida, o mRNA é transcrito utilizando uma reação de transcrição in vitro e então purificado.

Em seguida, o mRNA purificado é traduzido em um sistema de extrato S 30 de E. coli com aminoácidos radioativos para marcar a proteína sintetizada ou a cadeia polipeptídica nascente. Por fim, os segundos complexos de cadeia nascente ligados ao ribossomo Mr.Ed são isolados por gradiente de sacarose, centrifugação e fracionamento. Em última análise, os resultados podem demonstrar que as cadeias nascentes estão estavelmente ligadas ao ribossomo 70 S mediante análise por eletroforese em gel dos polipeptídeos marcados isolados das frações do gradiente.

A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como o uso de mRNA sem códon de parada, é que ela garante com alta eficiência a ligação da cadeia polipeptídica nascente ao ribossomo 70 S durante a tradução e a etapa subsequente de centrifugação. Além disso, em contraste com a tecnologia de ausência de códon de parada, este método pode ser usado com eficiência quase igual tanto em sistemas in vitro quanto in vivo. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no campo do dobramento proteico traducional, como a formação de intermediários de dobramento traducional nos estágios iniciais da tradução e auxiliar ainda na análise de suas estruturas por meio de estruturas diretas ou indiretas.

Abordagens de investigação e determinação Esta técnica pode nos ajudar a decifrar a via de dobramento proteico no ribossomo. Neste protocolo, descrevemos o isolamento de cadeias nascentes completas de gama B cristalina ligadas a ribossomos 70 s. No entanto, esta técnica pode ser utilizada para o isolamento de diversas doenças de praticamente qualquer proteína de interesse.

Essa estratégia também pode ser adotada para isolar cadeias polipeptídicas truncadas de natin na derme. Em geral, indivíduos novos nesse método podem ter dificuldades durante a etapa de centrifugação em gradiente de sacarose. No entanto, para quem tem experiência, isso não deverá ser um problema. Decidimos utilizar uma segunda sequência de estacionamento para isolar polipeptídeos nascentes de cristalina gama B ligados ao ribossomo 70S após tentativas iniciais, menos bem-sucedidas, que envolveram o uso de mRNA sem códon de parada.

A técnica posterior não conseguiu garantir a estabilidade dos CRCs durante as etapas subsequentes de centrifugação com a mesma eficiência do método que envolve o uso da sequência de parada SECM. A demonstração visual deste método é fundamental, pois as etapas que envolvem a preparação do gradiente e a separação dos CRCs podem ser difíceis de aprender, exigindo certo nível de experiência para assegurar resultados reprodutíveis. A demonstração do procedimento será realizada por um estudante de pós-graduação do meu laboratório, para realizar transcrição e tradução in vitro. Inicie com um gene de interesse clonado em qualquer plasmídeo baseado em T7 e/ou SP6 para gerar complexos ribossomo-cadeia nascente ou CRCs.

Estenda a extremidade C do polipeptídeo alvo adicionando a sequência indutora de parada de M para garantir que o fragmento do polipeptídeo seja extrudido para fora do túnel ribossômico. Adicione um ligador flexível rico em glicina e serina entre a proteína e a sequência de parada SEC M para preparar a transcrição in vitro; utilize uma enzima de restrição que corte a jusante da moldura de leitura aberta para linearizar o DNA molde e realize eletroforese em gel AROS para verificar a digestão completa da amostra. Após confirmar a concentração ideal de DNA, utilize um kit de transcrição de alto rendimento de acordo com as instruções do fabricante para sintetizar o RNA mensageiro.

Utilize a precipitação com cloreto de lítio para purificar o mRNA. Em seguida, analise uma amostra em um gel de acrilamida ou aros para verificar sua pureza. Para tradução in vitro.

Usando um sistema de e coli em água livre de nucleases, adicione uma mistura de aminoácidos de um milimolar, exceto metionina, 10 unidades de inibidor de ribonuclease, 20 microcuries de 35 s metionina, 20 microlitros de mistura de reação, 24 microlitros de tampão de reconstituição e 24 microlitros de lisado de e coli. Pré-aqueça a reação incubando-a a 30 graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, adicione um a dois microgramas de mRNA e incube por mais 10 a 15 minutos a 30 graus Celsius.

Interrompa a reação colocando-a no gelo para isolar os complexos de cadeia nascente ligados ao ribossomo 70 S ou ncs. Coloque a reação de tradução sobre 4,5 mililitros de um gradiente de sacarose de 5 a 30% em 20 milimolar de HEPES, hidróxido de potássio pH 7,5, 15 milimolar de magnésio, 100 milimolar de acetato de potássio e 1 milimolar de DTT. Centrifugue a 41.000 RPM durante duas horas a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, fracione o gradiente de sacarose utilizando um sistema programável de gradiente de densidade e um detector de absorbância ajustado a 254 nanômetros.

Colete as frações contendo ribossomos 70 s para análise adicional, a fim de determinar se a proteína estendida SEC M permanece ligada ao ribossomo 70 s. Precipite a proteína em cada fração do gradiente adicionando ácido tricloroacético. Incube as amostras durante a noite a quatro graus Celsius; no dia seguinte, centrifugue as amostras a 14.000 × g durante 15 minutos para obter o pellet proteico, e lave os pellets em uma proporção de quatro para um de acetona para tris 1 milimolar, HCl pH 7,6.

Seque os pellets ao ar, depois re-suspenda-os em tampão de carga para SDS-PAGE. Separe as amostras por SDS-PAGE em sistema Tris-Tricine, então fixe e seque os geis e submeta-os à auto-radiografia e imagem de fosfo como mostrado aqui. Após a tradução in vitro, os ribossomos 70 S foram isolados por gradiente de sacarose, centrifugação e fracionamento para garantir que a proteína gama B cristalina permaneça estavelmente ligada ao ribossomo.

As frações contendo 70 s foram reunidas, desalinizadas com troca de tampão e submetidas a uma rodada adicional de centrifugação em gradiente de sacarose. Os resultados apresentados aqui sugerem que o SEC M pode induzir eficientemente a parada traducional dos RNCs da cristalina gama B. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em um único dia de trabalho, com exceção da análise por eletroforese em gel da cadeia nascente, que geralmente envolve uma etapa de precipitação com TCA durante a noite.

Ao realizar este procedimento, é obviamente fundamental evitar a contaminação por RNAs em todas as etapas. A contaminação por RNS pode afetar a eficiência traducional do extrato e levar à liberação do polipeptídeo em formação do ribossomo 70S. Após seguir este procedimento, pode-se obter NAST e polipeptídeos de lanxess predeterminado estavelmente ligados ao ribossomo 70S, dependendo do objetivo final.

Esses complexos podem ser utilizados para diversas finalidades, como a determinação da confirmação de cadeias nascentes ligadas ao ribossomo por meio de abordagens diretas e indiretas, como RNM ou FRE, ou o teste de ligação de fatores e ligantes após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de biologia estrutural e dobramento de proteínas explorarem a confirmação de proteínas completas ligadas ao ribossomo, bem como intermediários de dobramento co-translationais. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar e isolar polipeptídeos nascentes, estavelmente ligados ao ribossomo 70 S, os quais podem ser utilizados posteriormente para responder diversas questões no campo do dobramento proteico translacional.

Não se esqueça de que trabalhar com isótopos radioativos e aminoácidos marcados, como, por exemplo, metionina A 35, exige precauções especiais e deve sempre ser levado em consideração ao realizar este procedimento.