Microfabricated Pós-Array-detectores (mPADs): uma abordagem para isolar Forças Mecânica

Olá, sou Nathan Snia Decky e comigo hoje estão Wes Ligan, Robbie Desai e Mike Yang. E somos do laboratório de Chris Chen aqui na Universidade da Pensilvânia. Neste vídeo, apresentaremos nossa abordagem para medir forças de atração celular utilizando um arranjo microfabricado de postes.

As forças de tração são geradas por meio de interações entre miosina e actina e desempenham um papel importante na nossa fisiologia. Durante o desenvolvimento, elas permitem que as células se desloquem de um local para outro a fim de formar as estruturas iniciais de nossos tecidos. Além disso, elas também auxiliam no processo de cicatrização, pois são necessárias para o fechamento de feridas ou para a migração e locomoção dos leucócitos pelo nosso organismo.

Mas, infelizmente, essas mesmas forças podem ser prejudiciais à nossa saúde no caso da metástase do câncer ou do crescimento vascular em direção a um tumor. Assim, existem muito poucos métodos com os quais é possível medir quantitativamente essas forças de tração, especialmente na escala micro e nanométrica de células individuais. A maioria dos métodos comuns para estudar células in vitro tem sido com placas de vidro no fundo ou placas de poliestireno, mas esses são substratos muito rígidos e não nos permitem medir fisicamente as forças de tração e as deformações causadas por uma célula.

Por isso, tem sido muito difícil compreender os mecanismos subjacentes às forças de tração sem algum tipo de leitura física. Assim, no laboratório de Chris Chen, temos uma técnica que nos permite superar essas limitações. Nosso método baseia-se em um arranjo vertical de microbarras flexíveis, cuja rigidez e escala de tamanho são tais que células individuais se espalham por múltiplas microbarras e as desviam no processo.

As dimensões que usamos com mais frequência são cilindros com três mícrons de diâmetro e dez mícrons de altura, com espaçamento centro a centro de nove mícrons, dispostos em um arranjo retangular. No entanto, essas dimensões podem ser alteradas para acomodar uma variedade de estudos celulares. Começamos com um molde rígido de silício, que você pode ver aqui, e depois os convertemos em microvãos flexíveis de PDMS, como vemos aqui.

Utilizando esta técnica, podemos medir os desvios de cantilevers individuais sob um microscópio e calcular as forças de tração celular com a magnitude e direção necessárias para gerar tais desvios. Transformamos esses substratos em M pads para detectores de matriz de microsuportes e, neste vídeo, mostraremos como fabricar os M pads, começando pelo molde de silicone, passando pela replicação em PDMS e, finalmente, até o cálculo da modulação e da contratilidade celular. Olá, estamos aqui na sala limpa do nosso laboratório.

Esta é uma sala livre de poeira e sensível à luz, que nos permite fabricar os postes de SU-8 que servirão como molde de silício. Começaremos com uma pastilha de silício e, com ela, iremos revesti-la com resistência fotográfica SU-8. O SU-8 é um resistente negativo e sensível à luz. Assim, quando expomos luz através desta máscara fotográfica, isso provocará a formação de um padrão luminoso nos micropostes e, posteriormente, a criação de uma estrutura tridimensional, que resultará nos postes de SU-8, os quais posteriormente serão moldados em PDMS.

Depois de realizarmos todo o processamento, a pastilha terá esta aparência, ou seja, com o micropilar e as estruturas de micropostes já fabricadas na pastilha. Para fabricar os moldes, começamos com uma pastilha de silício limpa, que foi tratada com ozônio por sete minutos e também desidratada por 30 minutos a 120 graus Celsius. Vamos centrifugar o SU-8 2002 sobre essa pastilha para formar uma camada base muito fina para os postes.

Como vamos centrifugar o SU-8, usarei uma máscara de gás, recarregarei a pastilha neste suporte aqui, removerei qualquer poeira que possa estar presente, colocarei sobre a centrífuga, verificaremos se está centralizada e, em seguida, procederemos com a aplicação do SU-8 2002 sobre ela. Depois, procederemos à centrifugação da pastilha. Em seguida, colocaremos estas na placa aquecedora, para a pré-secagem.

Fazemos isso durante um minuto após esse procedimento. Em seguida, transferimos para a placa aquecida a 95 graus. E mantemos por dois minutos.

E quando terminar, pegaremos isso agora e faremos a exposição uniforme no alinhador de máscaras. Ok, acabamos de centrifugar o SU-8, a primeira camada de SU-8 neste wafer, e agora precisamos expor uniformemente todo o wafer para criar a primeira camada base para os micropostes. Portanto, precisamos fornecer 70 milijoules de exposição.

Portanto, precisamos medir a intensidade real da luz em nosso alinhador de máscaras aqui. Então, colocamos o medidor dentro do alinhador de máscaras. Em seguida, expomos o medidor à luz.

Esta é a luz UV aqui. Carregamos a bolacha de silício no alinhador de máscaras e a colocamos dentro do alinhador. E desta vez não temos uma máscara, de modo que podemos expor todo o filme.

Vamos colocar o obturador e avançar para ajustar um minuto de exposição e, em seguida, realizaremos a exposição. Após um minuto, o sistema terminará e poderemos retirar a pastilha. Agora precisamos realizar o cozimento pós-exposição.

Então, acabamos de expor esta pastilha e agora vamos aplicar calor para provocar a reação de reticulação desta primeira camada de SU-8. Por isso, colocamos a pastilha em uma placa aquecida a 65 °C por um minuto e, em seguida, transferimos para uma placa aquecida a 95 °C por dois minutos. Após o processo de dois minutos, desligamos a placa aquecida e permitimos que a pastilha esfrie até a temperatura ambiente, o que leva cerca de 30 minutos.

Então, aplicamos a segunda camada de SU-8 nesta pastilha. E agora precisamos expor essa camada através da máscara fotográfica. Desta vez, vamos utilizar um filtro UV para bloquear a luz UV profunda.

Esta é uma lente óptica Hoya que você pode obter, mas desta vez precisamos novamente medir a intensidade. Então, vamos usar nosso medidor de luz ou vamos usar o filtro acima para medir a intensidade que foi filtrada. E então vamos carregar a máscara no alinhador de máscaras.

Essa chave cria um vácuo que mantém a máscara no lugar. Em seguida, colocaremos a máscara no alinhador de máscaras. Depois, colocaremos o filtro em cima e, em seguida, carregaremos nossa pastilha.

Queremos garantir um bom contato, então elevamos o substrato até o contato e, em seguida, iniciaremos a exposição. Após a exposição, retiraremos nossa pastilha do alinhador de máscara. Agora temos áreas que foram expostas seletivamente. Levaremos isso ao forno, às placas quentes, para realizar a etapa de cocção pós-exposição.

Então acabamos de realizar o PO, a etapa final de forneamento pós-exposição, e agora vamos revelar esta pastilha para obter as estruturas tridimensionais. O que faremos é lavar esta pastilha, revelando-a em P-G-M-E-A, o que removerá o SU-8 não exposto. Primeiramente, colocamos a pastilha em um recipiente com P-G-M-E-A e a deixamos por dois minutos com agitação suave.

Então, vou deixar isso agir por dois minutos. Em seguida, vamos transferir para um segundo recipiente contendo P-G-M-E-A. Isso removerá o P-G-M-E-A saturado com SU oito.

Após 10 segundos, vamos colocá-lo no IPA. Isso remove o P-G-M-E-A. Colocamos aqui por 20 segundos, novamente com alguma agitação suave.

Em seguida, temos agora as estruturas de postes autossustentáveis. Vamos colocar isso em hexano, que possui baixa tensão superficial. Vamos lavar por cinco segundos em um e depois em dois hexanos, e então já estaremos prontos para secar com jato de ar.

Então acabamos de desenvolver a pastilha e agora vamos colocá-la em uma placa aquecedora e aumentar lentamente a temperatura até 150. O que acontece é que essa temperatura mais elevada promove uma maior reticulação do SU-8, tornando-o mais rigidamente estrutural. Deixamos a pastilha nessa placa aquecedora durante a noite, por um período entre 14 e 20 horas. Posteriormente, desligamos a placa aquecedora e permitimos que ela esfrie novamente até a temperatura ambiente.

Então, o que precisamos fazer é cortar essa pastilha em um tamanho menor. Basicamente, queremos cortar essa pastilha de silício e criar um pequeno chip apenas com este padrão interno aqui. E ficará parecido com esta estrutura, onde utilizarão epóxi.

E vamos colar esse chip em uma lâmina de vidro assim. Isso fornece um suporte estrutural. Para cortar uma pastilha, é uma espécie de arte, mas o que você pode fazer é basicamente usar um estilete de diamante e começar em uma das bordas.

E por causa dos planos cristalinos, você faz apenas um pequeno entalhe. Agora foi criada uma fratura, que posso então tocar com esta ferramenta. Podemos destacar esta parte e fazer mais cortes aqui até obtermos uma estrutura pequena como esta. Em seguida, você coloca rapidamente o chip de silício sobre o vidro e o fixa no lugar. E deixa que isso se estabilize.

E então, depois de terminar, você terá um dispositivo semelhante a este. Montamos o molde de silício sobre esta lâmina de vidro e agora vamos aplicar um revestimento de floy, o que ajudará na liberação dessa estrutura do PDMS posteriormente. Vamos colocar o chip neste dessecador e então adicionar algumas gotas de tri Cloro Silano, colocando algumas gotas dentro do dessecador.

Fazemos isso dentro da câmara de fluxo laminar porque isso gera um subproduto de gás clorídrico, que é bastante agressivo. Feche a tampa, conecte-a ao vácuo e, em seguida, deixamos o sistema sob vácuo para que o depósito ocorra durante a noite, obtendo assim um bom revestimento em toda a extensão da pastilha de silício. Olá, sou Wesley Ligan.

Sou estudante de pós-graduação no laboratório de Christopher Chen. Neste ponto, Nate mostrou a você como criar um molde de silicone para nossos substratos ED. No entanto, antes que possamos usar essa ferramenta para medir a contratilidade celular, é necessário primeiramente replicar as estruturas rígidas fotoativadas utilizando um polímero de silicone elastomérico.

Nossa primeira tarefa é gerar um molde negativo do molde de silicone que fabricamos anteriormente. Fazemos isso utilizando um elastômero de silicone chamado PDMS ou poli(dimetilsiloxano) ao nosso polímero de PDMS. Agora adicionamos uma proporção de um para 10 de agente de cura.

Uma vez que temos a solução pesada, é necessário misturar completamente o polímero PDMS e o agente de reticulação. Essa mistura, obviamente, introduz muitas bolhas de ar na nossa solução. Assim, nesse momento, é necessário descobri-la e desgaseificá-la no dessecador a vácuo.

Uma vez que o PDMS esteja completamente desgaseificado e todas as bolhas tenham subido à superfície e estourado, podemos removê-lo do dessecador a vácuo. Agora podemos usar essa mistura de PDMS e agente de reticulação para gerar um molde negativo do nosso molde de silício. Para fazer isso, utilizamos uma forma de torta e colocamos o nosso molde de silício montado em seu centro.

Em seguida, despejamos cuidadosamente a solução polimérica de DGAs na placa sobre a superfície da pastilha de silício, tentando evitar a formação de bolhas adicionais. Normalmente, tentamos despejar o polímero com uma espessura de aproximadamente um quarto de polegada. Pode-se observar que este processo inevitavelmente introduz algumas bolhas de ar na mistura.

Agora, deixamos este recipiente de lado por aproximadamente 30 minutos para permitir que as bolhas subam até a superfície e estourem. Podemos observar que, após esse período de repouso, ainda há algumas bolhas de ar na superfície do PDMS. No entanto, como estão localizadas na superfície superior, podemos agora usar uma rápida rajada de nitrogênio para estourar quaisquer bolhas remanescentes.

Para realizar completamente a reticulação da solução de PDMS e REAGENTE RETICULANTE e gerar um molde negativo rígido a partir do nosso molde de silício, aquecemos a 110 graus Celsius por 20 minutos. Podemos observar que há uma camada fina de PDMS sobre o substrato de silicone. E antes de podermos separar os dois, é necessário primeiro cortar essa camada.

Então podemos enxertar esta camada superior e removê-la suavemente do substrato de silício. Neste ponto, podemos inverter e remover lentamente o substrato de silício negativo, o substrato de PDMS negativo, do molde de silicone. Ok, fazemos isso segurando uma das extremidades e removendo cuidadosamente o substrato de PDMS.

Você pode ver o avanço frontal conforme o substrato se desprende do molde-mestre de silicone. Agora que geramos o molde negativo A-P-D-M-S do nosso molde-mestre de silicone, podemos cortar este em quatro moldes negativos individuais para fabricar os substratos finais da placa. Neste momento, é importante não tocar a parte superior do substrato negativo com pinças ou luvas para evitar danificar a superfície.

Neste ponto, geramos quatro modelos negativos individuais a partir do molde mestre de silicone, consistindo em poços com diâmetro de três mícrons e profundidade de nove mícrons. Para regenerar as superfícies elevadas em balanço, podemos fazer uma nova moldagem sobre esses moldes negativos utilizando PDMS com PDI. No entanto, antes disso, é necessário tornar esses moldes negativos não adesivos, revestindo-os com um fluorossilano.

Fazemos isso em uma câmara de plasma de cem watts, na potência máxima, por um minuto. Após permitir que a câmara seja evacuada e o plasma seja restabelecido, isso gera um campo de gás iônico que ataca a superfície superior do PDMS e a torna mais adesiva às moléculas fluoro Cy Lane. Após remover os moldes negativos do dessecador a vácuo, pode-se observar aqui que o que nos resta é uma matriz de poços com três mícrons de largura por dez mícrons de profundidade, em uma camada de PDMS não adesiva.

Para regenerar os cantilever verticais, que utilizamos como substratos mpad, é necessário fazer uma nova moldagem a partir deste, usando a mesma mistura de PDMS, o que nos deixará com uma matriz positiva autossustentável de cantilevers elastoméricos, que espelham idênticamente o molde de silício que fabricamos anteriormente. O primeiro passo neste procedimento é transferir nossos moldes negativos não adesivos para uma montagem auxiliar que fizemos com tiras de PDMS e uma lâmina de microscópio de vidro. A razão para esse dispositivo ficará clara no próximo passo.

Neste momento, podemos depositar uma pequena gota da mesma mistura de PDMS para agente reticulante na proporção de 10 para 1, já dessurgida, sobre a superfície superior de cada um dos nossos moldes negativos. Apenas uma pequena quantidade de PDMS é necessária para que ela não escorra para as bordas dos moldes negativos. Neste momento.

Para espalhar mais completamente o PDMS sobre a superfície superior dos moldes, podemos pegar um deles com pinça, invertê-lo e colocá-lo em contato cuidadosamente com o molde adjacente, espalhando ao redor o PDMS para cobrir completamente todo o substrato. Tenha muito cuidado nesta etapa para não introduzir bolhas adicionais na solução superior de PDMS, que então pode ser repetida com os outros dois poços e os outros dois moldes. Agora que temos um revestimento de PDMS mais uniforme sobre a superfície superior, podemos colocar este dispositivo em um dessecador a vácuo para remover ainda mais quaisquer bolhas que possam estar aprisionadas na película de PDMS sobre nossos moldes negativos.

Esse processo geralmente leva cerca de 30 minutos. Enquanto nossos moldes negativos estão sendo desgaseificados, podemos limpar os substratos de vidro de 22 por 22 milímetros, que se tornarão o local final de montagem das pastilhas. O primeiro passo nesse processo é remover quaisquer partículas de poeira usando nitrogênio comprimido.

Vamos expor as lamínulas de vidro ao plasma gasoso, o que irá carbonizar a superfície e torná-la mais aderente ao PMS, que colaremos a ela na próxima etapa. Após permitir que a camada superior de PDMS entre em contato com as DGAs por aproximadamente 30 minutos e ativado as lamínulas de vidro com plasma, podemos então remover nosso molde e colocar a superfície superior das lamínulas de vidro, que foi exposta ao plasma gasoso, em contato com a camada de PDMS situada sobre os moldes negativos. Normalmente, é útil trazer primeiramente uma borda da lamínula de vidro em contato com o PDMS e, em seguida, permitir que o restante da lamínula se acomode em uma SH, de modo que o PDMS se espalhe de maneira uniforme, como uma lâmina.

Isso ajuda a reduzir quaisquer bolhas introduzidas no filme de PDMS. Neste momento, podemos pressionar suavemente a superfície superior da lamínula de vidro com nossa pinça para expelir qualquer excesso de PDMS, bem como posicionar a lamínula junto ao cruzamento de PDMS no centro do molde. Isso impedirá que a lamínula se mova durante a cura do PDMS.

Repetimos isso para os outros substratos. Neste momento, podemos transferir todo o molde para o forno e aquecer a 110 graus Celsius por 22 horas. Após permitir que todo o conjunto esfrie até a temperatura ambiente, podemos então remover nossos substratos, virá-los e cuidadosamente destacar o molde negativo do lamínula de vidro.

É importante fazer isso lentamente e de maneira uniforme para evitar esmagar os postes ou arrancá-los do substrato de vidro. Podemos ver que, após remover o molde negativo, ficamos com uma matriz de cantilevers que replica com precisão o Molde de Silício, só que agora eles são construídos a partir de um elastômero flexível de PDMS. Ok, então, até este ponto, mostramos como geramos o Molde de Silício dos nossos substratos Emad.

Em seguida, utilizamos um processo de moldagem por réplica para gerar uma réplica exata usando o polímero elástico A-P-D-M-S, de modo que as alavancas agora sejam flexíveis, permitindo que a célula se espalhe, contraia e deflexione as alavancas no processo. Neste ponto, nossos substratos estão prontos para o processamento para cultura celular. Agora que vimos como fabricar e replicar moldes para produzir os eds, vamos realizar mais algumas etapas para tornar o EDS funcional, de modo que possamos cultivar nossas células e posteriormente analisar as forças de tração.

Mas antes de fazermos isso, precisamos realizar três tarefas. Precisamos tornar as pontas dos postes adesivas às células. Em segundo lugar, precisamos rotular fluorescentemente o PDMS para auxiliar na visualização e na análise dos desvios dos postes.

Em terceiro lugar, precisamos tornar as paredes laterais e a base dos postes não adesivas às células, de modo que as forças de tração sejam exercidas apenas nas pontas dos postes. Assim, veremos nos próximos minutos como essas etapas são realizadas por meio de uma estratégia baseada em microimpressão por contato. Mas primeiro, o próximo passo é remover o excesso de P-D-S-P-D-M-S dos eds.

Então, como mencionei, o primeiro passo é pegar o substrato de EDS, que West acabou de mostrar como gerar e aparar. O excesso de PDMS resultante da cura da lamínula de vidro contra o molde negativo deve ser removido com uma lâmina de barbear afiada. Você faz isso posicionando verticalmente a lâmina sobre o substrato na borda dos pilares e, em seguida, raspando o excesso de PDMS.

E você pode usar um dedo para segurar a lamínula no lugar, de modo que ela não se mova. Assim, o que obtemos é um substrato de camada de MPAs que foi limpo de detritos e, portanto, é facilmente acessível. Para o próximo passo, precisamos imprimir por microcontato os MPAs para tornar as pontas dos postes adesivas.

Para fazer isso, primeiro precisamos gerar carimbos, e esse processo é muito simples. Basta misturar PDMS em uma proporção de um para trinta a um, em vez de uma proporção de dez para um. Despejamos em uma placa de Petri de modo que a altura do PDMS seja aproximadamente um centímetro.

Deixe desgaseificar. Ou seja, deixe as bolhas subirem até a superfície do PDMS e cure a reação de reticulação em estufa a 60 graus por uma hora. Após remover o recipiente da estufa e deixá-lo esfriar, agora estou pronto para recortar os carimbos. Assim, novamente com o mesmo tipo de lâmina de barbear, basta cortar pressionando verticalmente para baixo no PDMS até entrar em contato com o fundo da placa de Petri.

Agora, a orientação do carimbo é algo a que precisamos prestar atenção. A superfície do carimbo será o lado do PDMS que foi moldado contra o fundo da placa de Petri, de modo que permaneça plana. Assim, neste quadrado grande de PDMS que cortei, a superfície do carimbo está agora voltada para cima.

Agora, este carimbo é muito maior que os pads M, então vou cortá-lo até o tamanho de um único pad M novamente usando uma lâmina de barbear, porque é muito difícil identificar a orientação correta do carimbo a olho nu; por isso, vou fazer um pequeno entalhe no que será o lado traseiro do carimbo, ou seja, o lado não facial, assim como este. E então posso remover o carimbo do bloco maior. Agora tenho um carimbo A-P-D-M-S para o próximo passo.

Queremos limpar os carimbos de PDMS. Como é muito provável que poeira da atmosfera tenha se depositado sobre os carimbos de PDMS durante o corte. Este é um processo no qual colocamos o número desejado de carimbos de PDMS neste béquer de cristalização e preenchemos o béquer com etanol a 100%.

Então, basta adicionar etanol suficiente para cobrir a superfície dos carimbos, mas a quantidade exata de etanol adicionada não é importante. Em seguida, coloque o disco de cristalização em um ator e sonique os carimbos por cinco minutos. Após decorridos os cinco minutos, finalizaremos a esterilização dos carimbos e realizaremos o restante da impressão por microcontato, ou seja, a funcionalização dos pads M, em uma câmara de cultura tecidual estéril.

Agora estamos na câmara de cultura celular, onde podemos finalizar a esterilização dos carimbos. Para isso, retiramos os carimbos do recipiente de cristalização, mergulhamos em um recipiente cheio de etanol para remover qualquer resíduo remanescente e, por fim, mergulhamos em um recipiente com água para remover o etanol. Em seguida, com um fluxo de nitrogênio, secamos os carimbos até que não haja mais gotas visíveis.

Então, o próximo passo é encher os carimbos com uma solução proteica. A solução proteica que estamos utilizando é de 50 microgramas por mililitro de fibrina em água DEI. Basta aspirar um pouco da solução proteica com a pipeta e colocar gotas da solução na superfície do carimbo.

Você deseja fazer isso colocando pequenas gotas na borda da superfície do carimbo. Primeiro, repita isso para todos os carimbos que você for utilizar e eu deveria ter feito isso com antecedência. Assim, o próximo passo, após ter colocado pontos nas bordas de todos os carimbos, é conectar essas gotas e preencher a superfície do carimbo com a solução proteica.

O motivo pelo qual fizemos isso é que a solução proteica nas gotas e nas áreas logo abaixo das gotas torna a superfície do carimbo hidrofílica, facilitando a dispersão da proteína da matriz extracelular. Portanto, repita este procedimento para todos os carimbos que estiver usando. Agora que espalhamos a solução proteica sobre a face dos carimbos, o último passo do processo de tintagem dos carimbos é garantir que as bordas estejam cobertas. Para isso, basta inclinar uma pipeta e movê-la ao longo da face do carimbo, de modo que entre em contato com o canto do carimbo de PDMS e com a solução proteica simultaneamente.

E novamente, repita isso para todas as bordas de todos os carimbos que você estiver aplicando tinta. Agora que terminamos de aplicar tinta nos carimbos, colocamos os carimbos na câmara de cultura de tecidos por uma hora, a fim de facilitar a absorção completa da proteína na superfície do carimbo. Depois de esperarmos uma hora para que as proteínas se fixem e sejam absorvidas na superfície do carimbo, é hora de enxaguá-los com água e secá-los com nitrogênio.

Para fazer isso, pegamos água estéril e despejamos a água estéril na placa contendo os carimbos. Tenha cuidado para não despejar a água diretamente sobre a face do carimbo e você pode usar uma pipeta, se necessário. A quantidade exata de água não é importante, desde que você eleve o nível da água acima da solução proteica.

Depois disso, com pinças estéreis, pegue um carimbo, mergulhe-o em um novo recipiente com água e seque-o suavemente com nitrogênio. Novamente, você saberá que está seco quando não vir mais gotículas de solução proteica no carimbo. Repita esse procedimento para todos os carimbos que estiver processando, um de cada vez.

Agora que limpamos as cunhas e as deixamos secas, é hora de ativar os substratos de mpad tratando-os com ozônio UV. Durante sete minutos, retiro a tampa da placa de Petri, de cima da placa. Como o poliestireno absorve UV, coloco então a placa no tratador de ozônio UV, fecho a gaveta, ajusto o tempo para sete minutos e deixo agir.

Agora estamos de volta à capela de cultura de tecidos e é hora de carimbar os substratos de mpad, que acabaram de ser tratados com ozônio UV. Para isso, levante os carimbos lavados e secos com pinça. Você pode manipular os carimbos pelas laterais, mas não toque na face do carimbo.

Você deve ajustar o carimbo na pinça de modo que o lado da proteína fique acessível. Em seguida, inverta a pinça, lembrando que o lado da proteína fica voltado para baixo, e aproxime lentamente o carimbo do eds. Os carimbos de um a 30 são bastante adesivos, portanto você pode precisar usar um segundo par de pinças para soltar o carimbo da pinça.

Você pode soltar o carimbo de uma altura de cerca de dois milímetros a cerca de oito milímetros sobre os emeds. Em seguida, incline o recipiente dos emeds para cima e pressione suavemente com uma pinça para criar contato entre o carimbo e os eds. Você saberá que o contato foi feito de uma das duas maneiras seguintes.

O primeiro método é observar a superfície da ED através da lateral do carimbo. Isso pode ser difícil de ver pela câmera, mas a olho nu consigo ver claramente que o carimbo está fazendo contato com a superfície ao observar a superfície através da lateral do carimbo. A segunda maneira de garantir o contato é, com o p, retirar a placa de Petri da cabine de cultura celular com a tampa colocada e examiná-la em um microscópio invertido.

Ao visualizar os padrões de interferência com o microscópio, você deverá ser capaz de identificar quando, e se, o carimbo está em contato com os eds. Uma vez determinado o contato, o carimbo precisa permanecer em contato apenas por alguns segundos com o substrato ed. Portanto, agora é a hora de remover o carimbo.

Para fazer isso, dobre os Eds para baixo com um par de pinças e, com um único movimento suave, retire o carimbo. Certifique-se de acompanhar quais Eds você já carimbou e quais carimbos você já utilizou anteriormente. Repita este procedimento uma vez por EMPA para cada substrato que desejar usar.

Agora que carimbamos os EMPAs, o próximo passo é esterilizá-los e, em seguida, incubá-los em um corante lipofílico chamado dye eye. Dai é uma molécula lipofílica marcada com fluorescência, de modo que se difunde no PDMS ao longo de um período determinado, permitindo-nos visualizar as deflexões das hastes sob o microscópio. Então, o que vou fazer é pegar cada substrato de empa individualmente, um de cada vez, e imergi-lo em etanol 100%, etanol 70%, água DI, água DI, água DI, água DI.

E, finalmente, uma solução de cinco microgramas por mililitro de DII. A solução de DII é fluorescente; portanto, para minimizar sua exposição à luz ambiente e reduzir ao máximo o seu branqueamento fotônico, cobrimos as placas com folha de alumínio enquanto incubam na cabine de cultura de tecidos por uma hora. Agora que aguardamos uma hora para que os discos EM incubem na solução de DAI, podemos remover a folha de alumínio e remover a solução de DAI com lavagens.

Enxaguamos o material realizando três imersões sequenciais em água esterilizada e, finalmente, imergimos em uma solução de F1 27 a 0,2%. Ou seja, 0,2% peso por volume. Durante todas as etapas de imersão, é importante minimizar o tempo em que as almofadas de EM ficam expostas ao ar. Isso serve para prevenir danos aos substratos de ED e, especificamente, evitar que dois postes colapsem um sobre o outro.

O F1 27 a 0,2% é um copolímero em bloco tríplice composto por domínios hidrofílicos e hidrofóbicos. Sabe-se que o domínio hidrofílico resiste à absorção de proteínas e, consequentemente, à adesão celular, enquanto o domínio hidrofóbico se liga à superfície do PDMS hidrofóbico. Assim, quando o PDMS é imerso no F1 27, o F1 27 se liga ao PDMS e repele a adesão celular.

Após uma hora de incubação em F1 27 em uma placa de Petri coberta com papel alumínio, podemos remover o F1 27 por imersões sequenciais em água estéril, água estéril e PBS. Após a imersão em PBS e a remoção completa do produto F1 27, podemos então imergir os substratos eds na solução de cultura celular de escolha. A solução de cultura celular na qual acabei de imergir as EMPAs pode conter soro e/ou outros fatores de crescimento e/ou suplementos, como penicilina e estreptomicina.

Todos esses ingredientes são completamente compatíveis com os tratamentos EMPAs. Agora, o próximo passo, uma vez que os eds tenham sido imersos na solução de cultura celular, é semear as células de escolha sobre os eds. Para esta configuração experimental específica, vou semear células endoteliais aórticas pulmonares bovinas em três placas diferentes.

A razão pela qual estou usando três placas diferentes é porque tratarei duas das placas com inibidores de tactilidade conhecidos, a fim de inibir as deflexões dos postes, como poderemos avaliar em um momento posterior. Para semear as células, basta pegar minha suspensão celular, aspirar a quantidade apropriada na pipeta e adicionar gota a gota em cada placa. Adiciono células suficientes para que, quando realizar o ensaio para medir as forças de tração, as células existam como células isoladas nos eds.

A quantidade que você adicionará dependerá da área de distribuição, bem como da taxa de crescimento das suas células específicas. Normalmente, semeamos entre 1.500 e 5.000 células por centímetro quadrado de substrato. Após terminar de semear as células ou editar a suspensão celular, adicione gota a gota ao cultivo e agite suavemente o recipiente várias vezes para frente e para trás em direções ortogonais para misturar a suspensão celular no recipiente de cultura.

Repita este processo para todos os substratos que você estiver usando. Imediatamente após semear as células, coloque-as em uma incubadora a 37 °C, com um nível apropriado de dióxido de carbono para tamponar o pH e o meio de cultura celular. Cerca de duas horas após a semeadura das células, é apropriado lavar as células transferindo os substratos de um recipiente com meio para um recipiente novo contendo o mesmo meio de cultura celular.

O motivo dessa lavagem é que a maioria das células já terá começado a se espalhar e terá atingido quase sua área final de espalhamento em duas horas. Ao lavar as células, ou seja, os substratos, você está removendo quaisquer células flutuantes do meio de cultura celular. Dessa forma, apenas as células que se aderiram ao EDS e que estão iniciando o processo de espalhamento serão detectadas no ensaio final para forças de tração.

Um ensaio que podemos realizar com células cultivadas em MPAs é a microscopia com lapso de tempo para examinar quantitativamente a dinâmica da contratilidade celular. Em particular, é interessante analisar a dinâmica da contratilidade celular em resposta a fatores solúveis. Sabe-se que fatores solúveis, como compostos biológicos e compostos sintéticos, podem aumentar, reduzir ou ter efeitos desconhecidos sobre a contratilidade celular.

Para este experimento com células vivas, utilizaremos este microscópio invertido com fluorescência por epifluorescência. Na platina do microscópio, há uma pequena câmara de incubação conectada a um regulador térmico para manter a temperatura em 37 graus Celsius com 5% de CO₂. Realizaremos a imagem em alta ampliação com uma objetiva plan APO de 60x.

Agora vamos preparar o substrato de impacto para a aquisição de imagens. A objetiva de 60x que estamos utilizando para a aquisição de imagens possui uma distância de trabalho de 200 mícrons, o que é muito menor do que a espessura da placa de cultura de tecidos na qual semeamos as células anteriormente. Portanto, não podemos, não podemos observar células nos implantes dentro da placa de cultura de tecidos.

Para contornar esse problema, utilizamos esses recipientes com fundo de vidro. Agora, vou transferir o substrato para o recipiente com fundo de vidro de cabeça para baixo, de modo que as células e as pontas dos postes fiquem na interface do fundo de vidro. Assim, quando este for colocado no microscópio, a distância de trabalho entre as células e a objetiva será inferior a 200 micrômetros.

Agora estamos prontos para colocar isso em um microscópio para obtenção de imagens. Abrirei agora a câmara de incubação para células vivas, colocarei a amostra no interior e reposicionarei a tampa da câmara de incubação. Neste momento, examinarei o substrato em busca de uma célula adequada.

Para realizar a imagem. A maneira mais eficiente de fazer isso é utilizar uma objetiva de fase com ampliação 10x, o que me permitirá visualizar um campo mais amplo do substrato e encontrar uma célula mais rapidamente. Meus critérios para uma boa célula são a presença de uma única célula.

Não deve estar tocando em nenhuma célula vizinha, e também deve ter um tamanho médio em comparação com todas as outras células no substrato; encontrei uma célula adequada para observar. A próxima etapa será mudar a objetiva para 60x, a fim de observar a célula em alta ampliação. Para isso, desfocamos a objetiva, para que ela não atinja o estágio durante a rotação.

Ao girar a torreta para abrir a câmara, gire parcialmente o objetivo de 60 x para fora; o objetivo de 60 x é uma lente de imersão em óleo, portanto precisamos colocar uma gota de óleo de imersão sobre a lente do objetivo. Agora concluiremos a rotação da torreta para posicionar o objetivo de 60 x. Fecharemos a câmara de incubação e refocaremos o objetivo para trazer a célula novamente ao foco.

Uma vez que eu ajuste o posicionamento e o foco da célula, mudarei para a câmera CCD para visualizar a célula na tela do computador e, em seguida, iniciar a aquisição de imagens em lapso de tempo. Para este experimento, coletarei tanto imagens de contraste de fase quanto imagens fluorescentes em intervalos de um minuto; assim, a aquisição em lapso de tempo já foi iniciada e deixarei o processo rodar por 10 minutos ou 10 quadros. Neste momento, passados os 10 minutos, adicionarei soro. Agora abrirei a câmara e adicionarei soro ao recipiente para estimular a contratilidade da célula.

O cronômetro ainda está em execução, então preciso ser rápido ao fazer isso. Agora, continuaremos a realizar a aquisição de imagens da célula por 30 minutos para acompanhar quaisquer alterações na contratilidade. Após concluirmos a aquisição de imagens em lapso de tempo, as imagens podem ser sequenciadas em um filme para exibição. Aqui estão dois filmes das imagens de contraste de fase e de fluorescência.

À esquerda, há um filme de contraste de fase de uma célula predominantemente transparente, delimitada em preto. A célula se espalha pelas pontas de 20 hastes, que são as estruturas circulares dispostas em uma rede retangular. À direita, há um filme fluorescente da mesma célula, mas apenas as hastes são visíveis.

Se eu reproduzir esses vídeos, você verá que os postes ligados à célula são inicialmente fracos, claramente desviados e se afastam muito pouco da rede retangular. Na parte intermediária do vídeo, adicionei soro ao meio. O soro estimula a célula a aumentar sua contratilidade.

À medida que a célula exerce forças de tração maiores sobre os pinos subjacentes, os pinos ao longo do perímetro da célula começam a se desviar para dentro. No filme fluorescente, agora você vê os pinos se desviando significativamente de suas posições na rede retangular. Como descreverei posteriormente, o deslocamento dessas posições dos pinos nessas imagens pode ser utilizado para analisar as forças de tração dessa célula.

Anteriormente, vimos como geramos os substratos mpad e como os funcionalizamos para cultivar células. Agora você deve ter notado que coloquei os substratos mpad prontos em três placas de cultura celular diferentes. As células cresceram durante a noite, e agora o que vou fazer é tratar cada placa de cultura celular individualmente com um agente solúvel diferente que modula a contratilidade de maneira conhecida.

Podemos então medir de forma quantitativa as forças de tração que resultam após fixar as células por 30 minutos. Após adicionar os fatores solúveis 30 minutos depois da adição dos inibidores de contratilidade, é hora de fixar as células com paraformaldeído para manter o estado atual das forças de tração. Para isso, é importante usar paraformaldeído contendo cálcio e magnésio, e utilizamos paraformaldeído em uma porcentagem volumétrica de 3,7%. O método para imergir os substratos no paraformaldeído, desculpe, é o mesmo método para imergir os substratos nas diferentes RINs durante a funcionalização.

Ou seja, é importante não deixar os substratos secarem, pois isso pode levar ao colapso pós-fixação. Após transferir os substratos, deixo-os em incubação no paraformaldeído por 20 minutos. Após decorridos os 20 minutos, removemos os substratos do paraformaldeído; agora que as células foram fixadas, podemos processar essas amostras para coloração imuno-histoquímica padrão.

Para isso, colocamos os substratos com a face voltada para cima sobre o param e pipetamos PBS suficiente para cobrir o substrato e mantê-lo sob o PBS. Em seguida, lavamos o substrato três vezes com PBS para remover qualquer paraformaldeído que possa ter restado na cultura. Após a lavagem do substrato três vezes com PBS, podemos transferir o substrato para a imunomarcação subsequente.

Fazemos isso manipulando o substrato com um par de pinças e invertendo na primeira etapa da imunomarcação, que é um agente de permeabilização. Neste caso, estamos usando Triton X 0,2% em PBS. No entanto, o usuário pode utilizar qualquer agente de permeabilização que seja mais apropriado para suas necessidades.

Repetimos isso para todos os nossos substratos e assim é como manipulamos os substratos durante o processo de imunomarcação. Após a imunomarcação, os substratos são montados em uma lâmina de vidro padrão de uma polegada por três polegadas, que então pode ser analisada em qualquer microscópio de fluorescência epiluminiscente, seja invertido ou ereto. Ao processar as amostras em um microscópio confocal, podemos focar na base dos postes para obter as posições não desviadas, ou seja, as posições nulas.

Podemos então focar até as pontas dos postes, capturar outra imagem dos postes e, comparando a imagem superior com a inferior, medir as deflexões dos postes e calcular as forças de tração das células que as células geraram para produzir tais deflexões. Ao realizar esse processo para muitas células diferentes em várias condições distintas, podemos então comparar as forças de tração geradas nas diferentes condições. Agora que coletamos imagens de células vivas e fixadas, nossa próxima tarefa é medir a deflexão, medir as forças de tração nas células.

Para fazer isso, escrevemos um programa de computador em Matlab. Estas são as três imagens que utilizaremos nesta análise. A primeira imagem é uma imagem de fase da célula.

É útil para identificar a localização da célula. A segunda imagem é uma imagem fluorescente dos topos dos pinos. Utilizamos esta imagem para localizar as posições dos, dos pinos em suas extremidades.

Como você pode ver, alguns desses postes são desviados e se afastam da rede retangular na qual a maioria dos postes está localizada, como este poste. E este poste. A terceira imagem que usaremos é a imagem de base, que captura a posição dos postes em um plano focal que atravessa a, a, a base deles.

Neste nível, os postes desviados e não desviados devem estar localizados em suas posições de repouso, ou seja, posições não desviadas. Na rede retangular, pode-se observar que os postes que foram desviados na segunda imagem em sua base estão em sua posição FL. Esta imagem é utilizada para determinar a posição do poste em sua posição refletida.

Em seguida, carregamos o programa MATLAB, que nos solicitará o carregamento dessas três imagens. Dê um nome ao arquivo. Você verá a imagem de fase.

Iremos desenhar uma caixa ao redor da região indicando onde está a célula, para que o programa saiba quais hastes analisar. O programa então realiza a análise de intensidade, limiarização e segmentação da imagem recortada para determinar as coordenadas OID das hastes. À esquerda estão as imagens segmentadas das hastes da imagem superior, enquanto à direita estão as imagens segmentadas das mesmas hastes da imagem de base.

Após obter os pinos, as coordenadas OID, o programa pode então determinar os vetores de deslocamento entre a ponta e a base de cada pino. Esses vetores de deslocamento dos pinos podem ser convertidos em vetores de força multiplicando-os pela constante elástica do pino. Podemos analisar essas forças celulares de várias maneiras, como força média por célula ou força média por pino.

Um resultado útil é um gráfico de vetores no qual podemos visualizar a distribuição espacial das forças. Esta é a célula que acabamos de analisar e você pode ver que sobrepus setas amarelas nos postes, que se correlacionam com a magnitude da força e apontam na direção da força. Ao repetir esse processo de análise de imagem para sequências de imagens, como aquelas necessárias em nosso filme com lapso de tempo, podemos gerar uma sequência temporal.

Aqui está um filme da célula que estimulamos com soro. Como é possível observar, assim que o soro foi adicionado, a célula aumentou a contratilidade e desviou os postes ainda mais. Além disso, podemos quantificar as forças em um número maior de células submetidas a diferentes condições e posteriormente fixadas e coradas, conforme exemplificado por esses gráficos de setas que mostram uma célula tratada com um composto controle em comparação com células tratadas com inibidores de contratilidade.

Como você pode ver, os vetores de força na célula no caso controle são maiores em magnitude e comprimento do que os vetores de força nos dois casos em que foram utilizados inibidores da contratilidade. Abordamos muito conteúdo aqui para descrever o substrato patológico, desde a microfabricação até o preparo da amostra, experimentação e análise, demonstrando a versatilidade desses substratos.

Descrevemos dois ensaios diferentes: imagem de células vivas e ensaio com amostras fixadas, e realizamos a análise de células obtidas a partir desses dois ensaios, apresentando gráficos de vetores e filmes de vetores. Com esta ferramenta poderosa, pode-se realizar uma variedade de análises espaciais e temporais da contratilidade celular. Como você viu, este método baseou-se em diversas disciplinas diferentes, incluindo microfabricação, biologia celular básica, ciência de superfícies, análise e processamento de imagens, entre muitas outras.

E é precisamente porque seu método se baseia em diversas técnicas de engenharia que parâmetros como geometria dos postes, fatores solúveis induzidos e métodos para analisar as deflexões dos postes podem ser personalizados conforme as necessidades do usuário. É nossa expectativa que a demonstração visual deste método, que delineamos nas últimas 20, 30 minutos, possa ser utilizada como ponto de partida para outras e mais aprofundadas análises sobre a regulação, as consequências funcionais e a geração de forças de atração celular.