Mutagênese Bissulfito Único de ovócitos

O objetivo geral deste procedimento é analisar a metilação do DNA em um único ovócito. Isso é realizado primeiramente removendo as células do cúmulo e a palita de sabão dos ovócitos coletados. O segundo passo é embutir o ovócito em uma solução de lise de aros na proporção de dois para um, a fim de proteger a pequena quantidade de DNA contra perda ou degradação.

Em seguida, realiza-se a mutagênese com bisulfito, seguida de amplificação por reação em cadeia da polimerase aninhada. O passo final consiste em ligar e clonar o produto da PCR. Os clones são então selecionados, amplificados por PCR e enviados para sequenciamento.

No final, a mutagênese com bissulfito e o sequenciamento são utilizados para demonstrar a metilação do DNA em dinucleotídeos citosina-fosfato-guanina, ou CpG, de uma região de interesse em um único ovócito. A principal vantagem dessa técnica em relação aos métodos existentes, como a mutagênese com bissulfito em grandes números de células, é que os dados podem ser obtidos a partir de um único ovócito sem a necessidade de agrupar cito, viés de PCR e contaminação por células quiméricas. No dia da coleta dos ovócitos, prepare frescamente as soluções listadas no protocolo escrito; ao preparar as soluções, reduza a chance de contaminação do DNA trocando as luvas com frequência, utilizando ponteiras com filtro, mantendo os tubos inclinados quando abertos e recolocando as tampas em todos os tubos quando não estiverem em uso.

Inicie a coleta de OSI colocando os ovidutos dissecados do camundongo em meio M dois e rompendo a polpa M para extrair o complexo de células do cúmulo. Em seguida, separe os cítos do complexo de células do cúmulo utilizando uma solução de hialuronidase a 0,3 miligramas por mililitro em uma gota de 30 microlitros de meio M dois. Mantenha os cítos em solução apenas pelo tempo necessário para remover as células do cúmulo, pois exposições prolongadas podem danificá-los.

Lave os ovócitos em gotas de 30 microlitros de meio M2, transferindo os ovócitos de uma gota para outra. Remova periodicamente as células do cúmulo, para um total de três lavagens. Remova a zona pelúcida utilizando solução ácida de tiró.

Primeiro, coloque os ovócitos em uma gota de 30 microlitros de solução, depois transfira para outra gota de 30 microlitros. Qualquer meio carregado pode diluir o ácido e reduzir sua eficiência. Mantenha os ovócitos na solução apenas pelo tempo necessário para remover a zona, pois exposições prolongadas podem danificá-los.

Após a remoção da zona, lave novamente os ócitos em uma gota de 30 microlitros de meio M dois para realizar a inclusão em agarose. Primeiro, coloque a solução de lise em um bloco de aquecimento a 70 graus Celsius. Adicione a agarose de ponto de fusão baixa, ou LMP Agarose, pré-aquecida à solução de lise, produzindo uma proporção de dois para um de agarose para solução de lise. Em seguida, coloque um único ovócito em uma lâmina de vidro limpa com quantidade mínima de meio M dois.

O próximo passo é incorporar o único citoplasma na solução de agarose e lise. Isso deve ser feito rapidamente, pois a agarose endurece em temperaturas abaixo de 65 graus Celsius. Aspire 10 microlitros da solução de agarose e lise para dentro de uma ponteira de pipeta sob um microscópio.

Expulse suavemente cerca de um microlitro ou menos da solução de lise agros sobre a lâmina de vidro, permitindo que se misture com o meio mínimo. Levante suavemente o ovócito para dentro da ponteira do pipeto. Em seguida, coloque os 10 microlitros em um tubo einor com 300 microlitros de óleo mineral, de modo que a gota resultante assuma uma forma esférica.

Incube o tubo no gelo por 10 minutos para realizar a lise. Remova 300 microlitros de óleo mineral e adicione 500 microlitros do tampão de lise SDS. Incube a amostra durante a noite em banho-maria ajustado a 50 graus Celsius no segundo dia.

Prepare as soluções de mutagênese com sulfeto frescas conforme descrito no protocolo escrito. Inicie a mutagênese removendo completamente os 500 microlitros de tampão de lise SDS. Tenha em mente que qualquer tampão de lise remanescente diluirá os agros quando for aquecido, e as esferas serão mais suscetíveis à dissolução nas etapas subsequentes.

Após a remoção completa do tampão de lise, adicione 300 microlitros de óleo mineral. Incube a amostra por dois minutos e meio em um bloco térmico a 90 graus Celsius. Tenha cuidado para não misturar, agitar, estender ou variar a temperatura.

Após dois minutos e meio, incubar a amostra em gelo por 10 minutos. Para realizar a desnaturação, remover o óleo mineral e adicionar um mililitro de hidróxido de sódio 0,1 molar ao tubo, agitar e inverter o tubo de cinco a seis vezes.

Incube a amostra por 15 minutos. Em banho-maria ajustado a 37 graus Celsius, inverta o tubo a cada três a quatro minutos; a esfera deve flutuar no hidróxido de sódio. Observe que a esfera não está mais no fundo do tubo.

Para realizar o tratamento com sulfito, gire suavemente o tubo após a remoção do hidróxido de sódio. Adicione 300 microlitros de óleo mineral e 500 microlitros da solução de sulfito BIS. Tenha cuidado para evitar exposição à luz e incube o tubo por três horas e meia em banho-maria a 50 graus Celsius.

Agora realize a desnaturação. Primeiro, incube a amostra em gelo por três minutos antes de remover o óleo mineral e a solução de bisulfito. Após uma centrifugação suave, adicione um mililitro de hidróxido de sódio 0,3 molar, agite e inverta o tubo de cinco a seis vezes.

Incube a amostra por 15 minutos. Em banho-maria a 37 graus Celsius, invertendo a cada três a quatro minutos, novamente, a esfera deve flutuar no hidróxido de sódio antes de iniciar a PCR. Lave as amostras primeiramente centrifugando suavemente.

Em seguida, remova o hidróxido de sódio e adicione um mililitro de um XTE pH 7,5. Agite por cinco a dez minutos à temperatura ambiente. Após uma segunda centrifugação suave, remova o XTE 1X.

Repita este processo de lavagem duas vezes. Em seguida, adicione um mililitro de água destilada autoclavada. Agite por cinco a dez minutos à temperatura ambiente, centrifugue suavemente pela terceira vez e remova a água.

Repita a lavagem com água destilada duas vezes. Por fim, remova todo o sobrenadante, deixando apenas a esfera de aros. Verifique se o pH do sobrenadante é 5,0.

Se o sobrenadante ainda estiver muito básico, lave as esferas novamente com água bidestilada. Enquanto isso, adicione a mistura da primeira rodada de PCR ao tubo de PCR conforme descrito no protocolo escrito. Deslize o agitador sólido até a borda do tubo einor.

Em seguida, transfira cuidadosamente a agro velocidade para o tubo de PCR e aqueça a 70 graus Celsius por um minuto, misture e, então, proceda à amplificação conforme sugerido no protocolo escrito. Após a amplificação da primeira rodada, prepare a reação de PCR da segunda rodada utilizando cinco microlitros do produto da primeira rodada como molde. Certifique-se de pipetar abaixo da camada de óleo mineral.

Prossiga para realizar a segunda rodada de amplificação conforme indicado no texto como um teste diagnóstico. As amostras da segunda rodada podem ser cortadas com uma enzima de restrição específica para metilação ou cepa, e os produtos da digestão podem ser separados por eletroforese em gel de acrilamida a 8%. Quaisquer bandas heterogêneas resultantes representam mais de uma sequência; para clonar o produto da segunda rodada, ligue-o ao vetor e realize a clonagem TA conforme descrito no manuscrito que acompanha este vídeo. Após a clonagem TA, plaque toda a mistura da reação em uma placa de ágar e LB, suplementada com ampicilina, X-gal e IPTG, e incube a placa a 37 graus Celsius durante a noite.

Em seguida, adicione a mistura mestra de PCR de colônia ao tubo de PCR conforme indicado no protocolo escrito. Escolha uma colônia bacteriana branca da placa com a ponteira de uma pipeta e agite-a em 35 microlitros da mistura mestra de PCR de colônia em um tubo de PCR. Prossiga com a amplificação da suspensão conforme descrito no texto, seguido de eletroforese de quatro microlitros do produto de PCR em um gel de AGROS 1,5%.

Por fim, envie aproximadamente 30 microlitros do produto de PCR para sequenciamento de cinco PCRs de colônia por cito. Após obter os resultados de sequenciamento, os padrões de metilação podem ser lidos: qualquer citosina-guanina original que permaneceu inalterada estava metilada. Inversamente, qualquer citosina-guanina original que agora é uma timina-guanina estava desmetilada após amplificação por PCR aninhada utilizando primers convertidos por bisulfito.

É possível confirmar uma conversão bem-sucedida ao visualizar um tamanho correto do fragmento em um gel de arfos em metáfase individual. Dois ovócitos representam um alelo parental e, em teoria, possuem um padrão de metilação genomicamente impresso. Dessa forma, os produtos da segunda rodada de PCR podem ser testados para contaminação não intencional.

Uma enzima de restrição sensível à metilação do DNA pode ser usada para digerir o produto da PCR da segunda rodada, a fim de avaliar se ele contém um alelo metilado ou não metilado. Aqui, uma citosina metilada dentro da sequência de reconhecimento da enzima é clivada. Enquanto uma citosina não metilada, que é convertida em timina, não é mais reconhecida pela enzima e permanece não cortada, qualquer amostra de oócito em metáfase II que contenha ambos os alelos, metilado e não metilado, deve ser descartada, pois é indicativa de contaminação por células do cumulus ou inclusão do corpo polar, após a ligação e transformação.

A amplificação bem-sucedida da PCR de colônia pode ser visualizada em um gel AROS para garantir que as amostras com o tamanho correto do produto sejam enviadas para sequenciamento. Para este exemplo, o tamanho esperado do amplicon após a ligação é de cento e cinquenta e seis pares de bases. Aqui, o clone cinco apresenta um tamanho incorreto de amplicon e não deve ser enviado para sequenciamento.

A sequência de cinco clones individuais de um óvulo em metáfase dois deve produzir cinco padrões idênticos de metilação e taxas idênticas de conversão não CPG. Quaisquer amostras que contenham mais de um padrão devem ser descartadas. Como os óvulos em metáfase dois ovulados possuem duas cópias cromossômicas ou um corpúsculo polar anexo, existe a possibilidade de obter dois padrões de sequência semelhantes.

Os dados devem ser descartados de qualquer cito que apresente padrões de metilação altamente dissimilares. Como a contaminação por células do cúmulo não pode ser descartada ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se, primeiramente, de lavar múltiplas vezes os ovócitos em meio fresco, após o tratamento com HI IDE, para remover o maior número possível de células do cúmulo. Em segundo lugar, o agarose de ponto de fusão baixo irá endurecer em temperaturas abaixo de 65 graus Celsius, portanto trabalhe com cuidado, mas rapidamente.

E, por fim, o bisulfato de sódio e a hidroquinona são sensíveis à luz, portanto os tubos de reação e as soluções devem ser envolvidos em papel alumínio.