A gravação ótica da atividade neural supraliminares com resolução de uma única célula e um único pico

O objetivo geral do experimento FollowMe é registrar a atividade de disparo neural de um grande número de neurônios. Isso é alcançado observando o aumento da concentração intracelular de cálcio no corpo celular de um neurônio associado a cada potencial de ação, utilizando microscopia de fluorescência na primeira etapa. A excitação por dois fótons e um princípio de varredura de acesso aleatório são utilizados para registrar sinais fluorescentes de cálcio de 40 corpos celulares neuronais com alta resolução espacial e temporal.

No segundo passo, os momentos exatos dos potenciais de ação são extraídos dos sinais fluorescentes utilizando um algoritmo de desconvolução. Esta técnica pode ser usada para registrar a atividade de disparo de dezenas de neurônios. Os dados de disparo então podem ser utilizados para medir a informação mútua, a propagação de sinais entre populações neuronais ou as correlações neurais.

A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como os registros com microeletrodos, é que é possível registrar a atividade de disparo de neurônios de um grande número de células em uma população local. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais sobre a função cortical no nível de redes locais de neurônios, como a importância das correlações na busca de informações e as alterações na dinâmica das redes com a corticoplasticidade. Para a excitação com dois fótons, utiliza-se um sistema a laser de pulsos infravermelhos com pulsos de femtosegundo. É necessária uma alta potência de saída do laser para compensar as grandes perdas introduzidas pelos componentes ópticos do sistema.

Um pré-compensador por sistema consistente em dois prismas impõe uma dispersão de velocidade de grupo negativa aos pulsos a laser antes dos defletores ópticos acusto, a fim de compensar a dispersão temporal introduzida pelos AODs. Dois AODs com grandes aberturas desviam o feixe a laser em duas dimensões. Uma grade de difração reflexiva com 100 ranhuras por milímetro é posicionada a 13 centímetros atrás dos AODs para compensar a dispersão espacial introduzida por eles. Ao utilizar pulsos a laser curtos, o feixe a laser é direcionado, com dois telescópios de retransmissão, para a porta da câmera de um microscópio ereto.

As íris são posicionadas em intervalos regulares para alinhar os componentes ópticos. Um divisor de feixe dicróico posicionado à frente da objetiva transmite a luz de excitação no infravermelho até o espécime e reflete a luz de fluorescência proveniente do espécime em direção a um detector. Detectores de fluorescência em epi e trans coletam o sinal de fluorescência através da objetiva e do condensador; filtros de vidro colorido são colocados à frente dos detectores para impedir que a luz de excitação alcance os detectores.

Os ângulos de desvio do A OD são controlados por um computador equipado com uma placa conversora digital-analógica, que por sua vez aciona osciladores controlados por tensão. O sinal dos fotomultiplicadores é transmitido por meio de um filtro passa-baixa Butterworth com frequência de corte de 100 kilohertz e é digitalizado por um conversor analógico-digital com taxa de clock de 156,25 kilohertz antes de ser armazenado em um computador para análise. O alinhamento e o ruído elétrico são testados registrando-se a distribuição dos sinais fluorescentes com e sem luz laser em ganho baixo e alto dos fotomultiplicadores, bem como com e sem indicador. A varredura aleatória com dither depende da detecção de aumentos intracelulares de cálcio. O primeiro passo do protocolo é corar um grande número de neurônios com a forma éster de um indicador de cálcio por injeção em bolo.

Em seguida, registre a atividade do corpo celular em cada neurônio em quatro localizações durante 6,4 microssegundos em cada localização. Para selecionar os neurônios de interesse, adquira um quadro completo composto por 256 por 256 pixels. Em seguida, selecione manualmente os centros dos neurônios a serem registrados dentro dessa imagem.

Três pontos a uma distância de dois mícrons ao redor de cada centro são automaticamente adicionados pelo software de controle em cada ciclo. O sinal fluorescente é registrado a partir dos quatro locais em todas as 40 neurônios. O registro de todos os neurônios em um ciclo exige 1,536 milissegundos.

Repita essa gravação sequencial de todos os 40 neurônios por cinco segundos. A detecção de potenciais de ação a partir de sinais fluorescentes de cálcio somático depende de uma alta relação sinal-ruído. Uma alta relação sinal-ruído pode ser alcançada aumentando a intensidade de excitação.

No entanto, a intensidade de excitação só pode ser aumentada até um certo limite devido ao dano fotônico. Existe apenas uma janela muito pequena de intensidade de excitação em que o dano fotônico é baixo e a relação sinal-ruído é suficiente para detectar picos individuais, a fim de garantir que os sinais registrados estejam dentro da faixa de alta detecção de picos. Durante um experimento, diversos softwares de análise online desenvolvidos pelo nosso laboratório são utilizados.

Em seguida, calcule a taxa aproximada de fótons por neurônio a partir de uma janela de tempo curta do ruído de base de cerca de 100 a 200 milissegundos. O número de fótons e a taxa de fótons são calculados a partir dos valores de fluorescência ajustando a distribuição das variações relativas de fluorescência com esta equação, depois calcule a fluorescência de base a partir da mesma janela de tempo e represente-a como uma função do tempo ou dos ensaios. Mantenha a diminuição média da fluorescência de base abaixo de 0,0002 por segundo ajustando a potência do laser.

Porque a detecção de potenciais de ação diminui rapidamente ao exceder esse limite. Após isso, verifique as posições somáticas dos neurônios a cada 10 a 20 minutos adquirindo uma imagem de quadro completo. Ajuste as posições de gravação, se necessário.

Os sinais fluorescentes resultantes da atividade neural muitas vezes são distorcidos no tempo devido ao longo decaimento do transiente de cálcio. Neste procedimento, utiliza-se um método de desconvolução para recuperar os potenciais de ação e seus respectivos tempos a partir dos sinais fluorescentes. Aqui, usamos um algoritmo genético para determinar o modelo de sequência de potenciais de ação mais provável que se ajusta ao sinal fluorescente registrado.

Com cada iteração do algoritmo, a verossimilhança máxima aproxima-se assintoticamente do seu valor máximo, determinado pelo ruído das gravações de fluorescência. Em populações heterogêneas de neurônios, o sinal de cálcio induzido por potencial de ação pode variar entre os neurônios. Para análise não supervisionada de grandes conjuntos de dados, desenvolvemos um algoritmo que leva em consideração a variação do sinal de cálcio induzido por potencial de ação de neurônio para neurônio, evitando assim um grande número de detecções falsamente positivas.

A distribuição conjunta da amplitude e da constante de tempo de decaimento do transitório de cálcio evocado por um único potencial de ação é registrada em um conjunto separado de experimentos, utilizando o mesmo tipo de neurônios e sob as mesmas condições experimentais. Para levar em consideração mudanças lentas na linha de base e reduzir os custos computacionais da deconvolução, gravações mais longas são divididas em vários traçados mais curtos, de um a cinco segundos, para cada neurônio em cada registro. O algoritmo de deconvolução pode testar um grande número de modelos — até 1 milhão de modelos diferentes ou mais — e, para acelerar a deconvolução, um experimento é deconvoluído em até 10 computadores diferentes em paralelo.

Após a desconvolução, os dados de potenciais de ação são analisados e inspecionados. A probabilidade de disparo no histograma de tempo peri estímulo e a taxa de disparo do neurônio são calculadas de maneira automatizada. Abaixo estão os exemplos de um sinal fluorescente registrado com uma taxa de excitação muito baixa e outro com uma taxa de excitação muito alta dentro da janela de detecção.

Observe que cada exemplo mostra a resposta a um único potencial de ação. É apresentada aqui uma microfotografia de um corte cerebral agudo e duas pipetas de estimulação posicionadas na mesma coluna cortical. Na camada quatro, essas mostram as respostas neurais aos estímulos repetitivos, e este gráfico exibe a informação mútua de Shannon sinalizada pela população registrada de neurônios.

Aqui está a medição da propagação da atividade de disparos acima do limiar entre diferentes populações de neurônios corticais. Estes são os disparos detectados nos neurônios corticais, em resposta à estimulação elétrica das fibras tálamo-corticais. Ao registrar a atividade neuronal utilizando varredura de acesso aleatório, é muito importante registrar dentro da janela de detecção.

Caso contrário, é muito fácil acabar com conjuntos de dados inutilizáveis. A detecção óptica de potenciais de ação ainda está em sua infância. Há muito espaço para aprimoramento.

Com algumas melhorias, registramos de ainda mais neurônios. Com outras melhorias, poderemos inclusive registrar atividade em animais acordados e em comportamento.