Medição única célula de liberação de dopamina com simultânea de tensão-clamp e amperometria

O objetivo deste procedimento é medir o transporte reverso de dopamina em um neurônio submetido a fixação de voltagem, utilizando simultaneamente patch clamp e voltametria para medir a liberação de dopamina mediada por DAT. Isso é realizado primeiramente testando a integridade do eletrodo voltamétrico com dopamina. O segundo passo é posicionar o eletrodo voltamétrico próximo à célula e obter um registro de célula inteira do neurônio com uma pipeta de patch.

Em seguida, a voltagem da célula é controlada com a pipeta de patch e a dopamina liberada pela célula mediada pelo DAT é registrada simultaneamente com um eletrodo piroelétrico. O passo final consiste em adicionar o bloqueador do DAT e registrar novamente as correntes da célula inteira e da piroeletricidade, permitindo que a corrente especificamente mediada pelo transportador de dopamina seja subtraída. A importância desta técnica reside na capacidade de medir o transporte reverso da dopamina por meio do transportador de dopamina enquanto se controla simultaneamente a voltagem do neurônio dopaminérgico.

O sistema simultâneo de registro com clamp de patch e barometria exige um microscópio invertido com óptica DIC excelente e uma lente de longa distância de trabalho para gerar uma fonte de luz DC para o sistema. Com baixo ruído elétrico, conecte o farol do microscópio a uma bateria de carro. Os micromanipuladores hidráulicos são utilizados porque não contribuem significativamente para os níveis de ruído na nossa configuração.

Um manipulador destro é utilizado para o clamp de voltagem, gravação em célula inteira e o manipulador canhoto para a pirometria. Para preparar o eletrodo para gravação em célula inteira, puxe uma pipeta de quartzo com um puxador P 2000. Normalmente, utilizamos uma pipeta com uma resistência de três a quatro megaohms.

Em seguida, preencha o eletrodo com a solução de micropipeta contendo dopamina a um milimolar. Depois, monte-o no suporte de micropipeta no manipulador direito. Certifique-se de envolver o recipiente que contém a solução de micropipeta com dopamina em folha de alumínio e mantenha-o em gelo quando não estiver em uso.

Como a dopamina é oxidável, manter a solução em gelo e protegida da luz reduzirá a taxa de oxidação. Passe o fio de prata pelo suporte do eletrodo, em seguida encaixe o adaptador paramétrico am no suporte do eletrodo. Depois, encha o eletrodo tric com quantidade suficiente de mercúrio para que entre em contato com o fio de prata.

Quando o eletrodo for montado no adaptador, certifique-se de inspecionar ao microscópio a fibra de carbono de baixo ruído pro CFE e o eletrodo paramétrico para garantir que a ponta esteja limpa e intacta. Certifique-se de segurar a extremidade oposta da fibra de carbono para proteger a ponta da fibra de danos. Em seguida, monte o eletrodo Tric pro CFE.

Posteriormente, monte o eletrodo montado no manipulador hidráulico esquerdo para examinar a integridade do eletrodo tric. Abaixe-o em uma placa de Petri com fundo de vidro contendo a solução externa. Registre a corrente de base na ausência de dopamina.

Em seguida, adicione 10 microlitros de uma solução de dopamina a um milimolar ao recipiente. Um bom eletrodo emperométrico deve registrar um aumento na corrente oxidativa. Certifique-se de verificar a integridade do eletrodo emperométrico antes e após os experimentos.

Neste procedimento, retire os neurônios dopaminérgicos ou células modificadas para expressar o transportador de dopamina colocados no fundo de vidro da placa de Petri do incubador. Lave suavemente as células ou neurônios dopaminérgicos três vezes com solução externa aquecida. Para visualizar as células e realizar o experimento, monte a placa de Petri com fundo de vidro na platina do microscópio e localize o ponto focal correto para visualizar claramente as células.

Em seguida, aplique pressão positiva ao eletrodo de patch. Usando uma seringa de um mililitro, introduza suavemente ambos os eletrodos na solução e aproxime-os da célula com os micromanipuladores. Em seguida, posicione o eletrodo emper métrico no lado esquerdo da célula e o eletrodo de patch no lado direito.

Quando o eletrodo de grampo estiver tocando a célula, aplique sucção leve com a boca ou com uma seringa para formar um selo gigasseal na célula. Em seguida, rompa o selo com sucção para obter a configuração de célula inteira e aguarde de cinco a oito minutos para a diálise da solução interna contendo dopamina dentro da célula.

Em seguida, registre as correntes mediadas por DAT aplicando um degrau de voltagem na membrana celular entre menos 60 e mais 100 milivolts a partir de um potencial de retenção de menos 40 milivolts através da pipeta. Para determinar o fluxo específico de dopamina mediado por DAT, registre as correntes eletrométricas na ausência e na presença de um antagonista de DAT. A corrente tric específica mediada por DAT é então determinada subtraindo-se os traços registrados na presença do antagonista de DAT dos traços eletrométricos registrados sem o antagonista.

Um desvio ascendente nas correntes tríplices corresponde a um fluxo externo de dopamina mostrado aqui. Correntes mediadas por DAT registradas por meio de incrementos de 20 milivolts na voltagem da membrana entre menos 60 e mais 100 milivolts a partir de um potencial de retenção de menos quatro milivolts, com a pipeta contendo dopamina 2 milimolar no modo de configuração de célula inteira. Aqui está a corrente eletrométrica adquirida simultaneamente com a corrente de célula inteira.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como medir o transporte reverso de dopamina por meio do transportador de dopamina em um neurônio com fixação de voltagem. Lembre-se de verificar a integridade do eletrodo paramétrico antes e após os experimentos, e não se esqueça de subtrair os traçados registrados na presença do antagonista dos traçados registrados sem o antagonista.