Síntese em Fase Sólida de um funcionalizada Bis Peptide-Usando o "Safety Catch" Metodologia

O objetivo geral do experimento a seguir é sintetizar um peptídeo BSP funcionalizado utilizando técnicas de fase sólida. Isso é alcançado carregando um aminoácido BIS protegido em resina de ácido hidroxietilbenzoico. Em seguida, ciclos de acoplamento com proteção profunda são repetidos para ligar aminoácidos bis funcionalizados, um processo que alonga o peptídeo BIS e exibe a funcionalidade desejada.

Por fim, o primeiro aminoácido bis é modificado com um aminoácido alfa a fim de clivar o peptídeo BIS da resina por meio da formação de pirazina DI-cetônica. Os resultados obtidos demonstram a síntese bem-sucedida de um peptídeo BSP funcionalizado com boa pureza bruta e rendimentos isolados consistentes de aproximadamente 10%, com base na análise por espectrometria de massas com cromatografia líquida. As implicações dessa técnica estendem-se à síntese paralela e em bibliotecas de peptídeos bis, pois os peptídeos BIS são montados em uma resina sólida, que é mais facilmente manipulada do que reações em solução, e os subprodutos são removidos com facilidade por filtração.

A demonstração visual deste método é essencial, pois muitas das etapas são difíceis de aprender, já que existem muitos detalhes importantes necessários para garantir que todas as reações alcancem a conclusão o mais próximo possível. Na síntese em fase sólida, não há como purificar os intermediários. Portanto, para obter um produto final puro, cada reação deve ser conduzida ao máximo possível.

Recomenda-se criar uma lista de verificação dos procedimentos experimentais para evitar confusão, já que as etapas são repetitivas por natureza. Este protocolo inicia-se com a carga do primeiro peptídeo BSP, a proteção do primeiro peptídeo BSP e o capeamento simultâneo da resina. Para iniciar, carregue o primeiro peptídeo BSP pesando 114 miligramas da resina H-M-B-A-A em um vaso de reação de oito mililitros e adicione uma barra de agitação magnética.

Tampe a parte superior do recipiente com a rolha de borracha e purgue o tubo com argônio por pelo menos cinco minutos. Enquanto isso, prepare a solução ativada de aminoácido BIS conforme descrito no protocolo escrito. Acompanhando este vídeo, transfira a solução para o vaso de reação por meio de uma seringa e agite sob argônio durante a noite. No dia seguinte, remova a rolha e drene a mistura de reação.

Lave a resina adicionando aproximadamente dois mililitros de clorometano à resina. Agite por 30 segundos a um minuto e, em seguida, drene. Repita este processo quatro vezes com DCM e, depois, lave a resina cinco vezes com dimetilformamida.

Para realizar a desproteção profunda do primeiro bisaminoácido e o bloqueio simultâneo da resina, adicione lentamente dois mililitros de uma solução de 33% de brometo de hidrogênio em ácido acético e DCM ao vaso de reação. Deixe sob agitação por 15 minutos após drenar e lavar a resina cinco vezes com DCM. Repita a sequência de desproteção D mais uma vez.

Em seguida, lave a resina cinco vezes com DCM seguido por cinco vezes com DMF, neutralize a resina lavando duas vezes com a solução de D-I-P-E-A em DMF a 5% volume por volume. Em seguida, lave cinco vezes com DCM e mais cinco vezes com DMF novamente. Agora pode-se realizar o acoplamento do bis aminoácido funcionalizado protegido.

Primeiro, reintroduza uma atmosfera inerte ao vaso de reação contendo a resina lavando-o três vezes com DCM anidro. Em seguida, fixe uma séptula e purgue e lave o vaso com linha de argônio adicionando um a dois mililitros de DCM anidro e agitando por 30 segundos. Depois, drene o vaso até que o borbulhador da linha de argônio comece a subir.

Repita este processo pelo menos mais uma vez. Em seguida, prepare uma solução de bis aminoácido funcionalizado em um tubo de ensaio seco à chama sob atmosfera de argônio. Adicione 47 microlitros de DIC e agite por 90 minutos.

Em seguida, adicione 35 microlitros de D-I-P-E-A em 666 microlitros e DMF Hydrus à resina e agite por mais cinco minutos. Transfira a solução pré-ativada do aminoácido BIS para o recipiente por meio de seringa e agite durante a noite no dia seguinte. Drene a mistura de reação e lave duas vezes com DCM anidro sob argônio.

Uma etapa crítica deste procedimento são as acoplamentos de aminoácidos biz. Para garantir o fechamento dos anéis de di-ceto piperazinas, empregamos tempos de reação mais longos com agentes ativadores adicionais. Para promover o fechamento da di-ceto pirazina, adicione uma solução de HOAT e DIC e agite sob argônio por uma hora.

Em seguida, remova o septo e drene a mistura de reação. Lave a resina cinco vezes com DCM e cinco vezes com DMF. Esta seção aborda a proteção profunda do aminoácido BIS funcionalizado, a proteção profunda do F moc e a acilação do primeiro aminoácido BIS.

Para realizar a desproteção profunda do bisaminoácido funcionalizado protegido, adicione lentamente dois mililitros de uma solução de TFA e TIPS ao vaso de reação e agite por uma hora após o escoamento; lave a resina com DCM por cerca de 30 segundos e, em seguida, escoe, repetindo a lavagem com DCM cinco vezes. Em seguida, repita toda a sequência de lavagem de desproteção profunda da resina seguindo a lavagem A-D-C-M-D-M-F. Neutralize a resina lavando-a duas vezes com uma solução 5% volume/volume de D-I-P-E-A em DMF.

Em seguida, realize uma nova lavagem D-C-M-D-M-F. A partir daqui, o peptídeo BIS pode ser alongado com outros bis aminoácidos funcionalizados ou funcionalizado no ácido carboxílico do nitrogênio terminal, ou ambos. Para desproteger o grupo FM, adicione uma solução de dois mililitros de 20% de piperidina em DMF e misture a reação por 20 minutos.

Drene e lave a resina cinco vezes com DMF. Repita este processo mais uma vez após uma lavagem adicional da resina. A isole o primeiro bisaminoácido adicionando a solução de aminoácido preparada ao vaso de reação e agite por seis horas como etapa final.

Lave a resina cinco vezes com DCM e cinco vezes com DMF. A etapa final deste protocolo inclui a remoção do grupo Bach do aminoácido ligado à resina e a clivagem da resina. Primeiro, adicione dois mililitros de uma solução de T-F-A-D-C-M na proporção um para um ao vaso de reação e agite por 30 minutos.

Escoe e lave a resina cinco vezes com DCM. Em seguida, repita este processo mais uma vez. Lave e escoe a resina por 30 segundos, cinco vezes com DCM e cinco vezes com DMF.

Em seguida, adicione dois mililitros de uma solução de 10% de D-I-P-E-A em DMF anidro e agite por 24 a 48 horas. Por fim, colete a mistura reacional em um balão de fundo redondo previamente pesado. Transfira 30 microlitros desta solução para 450 microlitros de Tetra Hidro FU em um frasco de LC-MS e envie para análise.

Lave a resina com alíquotas adicionais de DMF e colete no frasco de fundo redondo. Os seguintes métodos podem ser utilizados para monitorar transformações químicas na resina durante a síntese. Para detectar grupos hidroxila livres, realize o teste com vermelho de metila removendo primeiro cerca de um miligrama de resina seca por meio de pipeta descartável.

Lave em um vaso de reação de quatro mililitros. Adicione uma solução de vermelho de metila preparada conforme descrito no texto e agite por cinco a 10 minutos. Drene e lave a resina cinco vezes com DCM; bolinhas de resina laranja ou vermelhas indicam a presença de grupos hidroxila livres.

Este teste pode ser utilizado para avaliar a etapa de carregamento do primeiro aminoácido bis e as etapas de tamponamento da resina. Para detectar aminas secundárias, realize o teste do cloral transferindo aproximadamente um miligrama de resina seca para um pequeno frasco via pipeta descartável. Adicione três gotas da solução de cloral 0,8 milimolar em DMF e três gotas da solução de aldeído ácido 2% em DMF.

E vamos deixar em temperatura ambiente por cinco a 10 minutos. Neste caso, as esferas de resina azuis ou roxas indicam que aminas secundárias livres estão presentes no composto ligado à resina. Para confirmar as eficiências de ativação, realize o teste de aprisionamento de ativação: o composto ativado durante a síntese pode ser avaliado transferindo-se cinco a 10 microlitros da solução ativada para um frasco de cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas contendo 50 microlitros de olaina, misturado manualmente.

Por alguns segundos, a solução deve ficar amarela, depois dilua com 450 microlitros de tetra-hidrofuran e submeta à análise por LC-MS. O produto final e os intermediários ativados podem ser avaliados usando um sistema LCM-S equipado com uma coluna C18 de fase reversa e um sistema de solventes de água e acetonitrila com 0,1% de ácido fórmico. Este traçado L-C-M-S-U-V fornece um exemplo da boa pureza do produto bruto.

O pico principal no espectro encontrado aos 21,3 minutos apresenta uma máscara compatível com a massa do produto esperado. Isso pode ser visualizado no espectro de massas do produto bruto, cujo pico revela picos principais correspondentes à massa, mais a massa do íon sódio, bem como à massa menos a massa do grupo protetor IV DDE. É mostrado aqui o traçado UV de LCMS dos espectros purificados, revelando um produto muito puro aos 21,3 minutos, e o espectro de massas confirmando a identidade desse pico trier purificado.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como utilizar técnicas de síntese em fase sólida para produzir bis peptídeos funcionalizados após seu desenvolvimento. Esta técnica abriu caminho para que pesquisadores na área de bis peptídeos explorassem aplicações em interações proteína-proteína e catálise, uma vez dominada. Quando realizada corretamente, esta técnica pode levar à síntese de um trímero de bis peptídeo funcionalizado em quatro a cinco dias.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de manter as esferas imersas nas soluções de reação e de lavagem seguindo este procedimento. Outros métodos, como síntese paralela ou em biblioteca, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como o efeito da estereoquímica ou de funcionalidades alternativas na ligação proteica ou na atividade catalítica. Não se esqueça de que trabalhar com reagentes orgânicos pode ser extremamente perigoso e precauções, como o uso de equipamento adequado de segurança pessoal e capela de exaustão, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.