A fase líquida ensaio de captura de afinidade usando pérolas magnéticas para estudar interação proteína-proteína: O Exemplo Poliovírus Nanobody-

Este protocolo utiliza a interação entre o poliovírus e nanocorpos que reconhecem o poliovírus para demonstrar um ensaio simples de captura por afinidade em fase líquida e quantitativo. Em princípio, esferas magnéticas revestidas com cobalto são usadas para precipitar proteínas marcadas, bem como quaisquer proteínas marcadas com radioisótopos que interajam. Primeiro, misture as proteínas marcadas e incubate à temperatura ambiente.

Em seguida, adicione esferas magnéticas que reconhecem a marcação, separe a fração ligada da proteína marcada da fração não ligada utilizando ímãs. Em seguida, meça o sinal da proteína marcada encontrada na fração não ligada e determine a quantidade de proteína marcada presente na fração não ligada. Os resultados desse ensaio de afinidade em fase líquida são extremamente úteis quando proteínas sensíveis à conversão conformacional são analisadas.

Este ensaio de captura por afinidade em fase líquida pode fornecer informações sobre a interação entre o poliovírus, nanoanticorpos reconhecedores e diferentes antígenos do poliovírus. O método também pode ser aplicado a outras interações entre proteínas, desde que uma proteína possa ser marcada e a outra possa ser detectada. Tivemos pela primeira vez a ideia para este método quando estávamos interessados em investigar a interação entre o poliovírus, nanoanticorpos reconhecedores e diferentes antígenos do poliovírus.

Como o poliovírus é sensível à conversão conformacional quando ligado a uma superfície sólida, o uso de LSA é limitado. Portanto, deve-se preferir um sistema baseado em fase líquida. Um exemplo de tal sistema baseado em fase líquida, frequentemente utilizado na pesquisa com poliovírus, é a microproteína.

Um ensaio de imunoprecipitação. Embora este teste tenha demonstrado sua aplicabilidade, ele exige a estrutura cristalizada de um anticorpo convencional, que está ausente nos nanocorpos. Esses nanocorpos, que são anticorpos de domínio único interessantes e muito estáveis, podem ser facilmente modificados com diferentes sequências.

O marcador His é amplamente utilizado e mostra afinidade por íons bivalentes, como níquel e cobalto, os quais, por sua vez, podem ser facilmente revestidos em microesferas magnéticas. Desenvolvemos, portanto, um ensaio simples e quantitativo de captura por afinidade baseado em microesferas magnéticas revestidas com cobalto.

Agite o estoque de microesferas magnéticas em vórtex e transfira 10 microlitros para cada amostra em um tubo. Peliculize as microesferas utilizando um ímã. Remova o sobrenadante claro para lavar as microesferas. Adicione 150 microlitros de tampão de ligação.

Colete as microesferas utilizando um ímã e remova o sobrenadante após uma segunda lavagem. Re-suspenda as microesferas em 40 microlitros de tampão de ligação para cada amostra a ser controlada. Para o fundo na amostra um, prepare um poço sem vírus radiomarcado, mas com volume igual de tampão de ligação para controle.

Amostra dois de 100% de atividade radioativa. Adicione todos os componentes em um poço, exceto substitua o nanocorpo pelo tampão de ligação. Agora, adicione 2000 contagens por minuto do poliovírus marcado com S 35, cepa sete do tipo um, em um volume total de 80 microlitros de tampão de ligação a todas as amostras.

Aceite o controle. Amostra um. Adicione 10 microlitros da diluição do nanocorpo a cada amostra.

Agite bem por 10 segundos em um agitador e incube por uma hora à temperatura ambiente. Em seguida, adicione 40 microlitros da suspensão de microesferas magnéticas lavadas e incube por 10 minutos à temperatura ambiente sob agitação contínua, pelotize as microesferas com um ímã e transfira o sobrenadante clarificado para um tubo para medir a radioatividade de cada amostra; transfira 50 microlitros do sobrenadante para um frasco de contagem. Adicione três mililitros de mistura de fluido de cintilação e leia neste equipamento.

Realize uma força contrária nas microesferas magnéticas usadas em um tubo utilizando água e centrifugue a 500 ×g durante dois minutos. Descarte o sobrenadante e re-suspenda as microesferas em seis mililitros de hidróxido de sódio 0,5 molar. Em seguida, alíquotas da suspensão em múltiplos tubos e incube em banho ultrassônico por cinco minutos.

Após centrifugar as esferas com um ímã e remover o sobrenadante, adicione um mililitro de solução de SDS 2% a cada tubo, em seguida misture por vortexamento e envolva com papel alumínio por cinco minutos. Agora, recolha as esferas. Adicione um mililitro de EDTA 0,2 molar, pH 7, a cada tubo e incube os tubos em banho ultrassônico por cinco minutos.

Em seguida, colete as esferas, lave-as com um mililitro de água três vezes, seguido por um mililitro de solução de cloreto de cobalto 10 milimolar. Coloque os tubos em agitação durante 10 minutos. Prossiga para recolher as esferas em um ímã e ressuspenda-as em um mililitro de tampão de ligação.

Lave duas vezes em um mililitro de etanol 20%, e finalmente reconstitua as esferas em seu volume original de etanol 20% para obter esferas regeneradas numa concentração de 40 miligramas por mililitro. Corrija a radioatividade de fundo ajustando o controle. Use a amostra um como valor de 0% de radioatividade e a amostra controle dois como valor de 100% de radioatividade.

Agora, para cada amostra, calcule a porcentagem de radioatividade no precipitado como uma medida da precipitação global do vírus marcado por radioisótopo pelo nanocorpo. Este experimento avalia a afinidade do PVSS 38 C e de um anticorpo específico para poliovírus utilizando três antígenos diferentes do poliovírus: antígeno nativo, antígeno aquecido e subunidades de 14 s. Curiosamente, a radioatividade no precipitado das amostras contendo subunidades de 14 s marcadas com radioisótopo diminui com o aumento das concentrações do nanocorpo PVSS 38 C. Isso indica um aumento na quantidade de subunidades de 14 s do poliovírus ligadas ao nanocorpo PVSS 38 C e, indiretamente, às microesferas magnéticas.

Como nenhuma afinidade do pvs S 38 C pela forma antigênica N e pela forma antigênica H do poliovírus é observada, o nanocorpo parece ser específico para a subunidade de 14 s do poliovírus. A afinidade do nanocorpo em relação aos seus antígenos, medida por este método, é específica, já que o nanocorpo não relacionado, NB um, não apresenta reatividade contra as três formas antígenicas do poliovírus.

Este sistema produz alta reprodutibilidade, conforme indicado nesta curva de resposta à dose gerada por diferentes pesquisadores em dias distintos. Uma vez dominado, este ensaio confiável de captura por afinidade em fase líquida pode ser adequadamente realizado em até duas horas, incluindo o reciclamento das partículas magnéticas. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como utilizar este ensaio de captura por afinidade em fase líquida baseado em partículas magnéticas ao estudar a interação entre diferentes proteínas, especialmente quando sistemas baseados em fase sólida não podem ser utilizados.