Geração, purificação, caracterização e de Cell-invasivos espécies de proteína Disc1

O objetivo geral dos procedimentos a seguir é gerar discos purificados. Um agregado capaz de invadir células receptoras. Dois métodos diferentes para alcançar esse objetivo serão demonstrados com o primeiro método.

A proteína fluorescente disc uma fusão formadora de asomo é superexpressa em células doadoras de neuroblastoma humano NLF. As células são então lavadas com PBS, coletadas e lisadas sem o uso de detergentes. O DNA é digerido e as zonas de agregação são purificadas utilizando um sistema de gradiente de sacarose.

Agrios purificados por este método apresentam baixa eficiência de invasão celular. A abordagem alternativa consiste em superexpressar os aminoácidos 598 a 785 da proteína disc recombinante em *E. coli*. O fragmento proteico é então marcado com DITE 594, diálise é realizada e a purificação é efetuada utilizando uma matriz NI-NTA, que remove qualquer corante não ligado remanescente e disc multimérico.

Os fragmentos gerados por este método apresentam alta eficiência de invasão celular para avaliar a invasão de células hospedeiras. Pode-se utilizar o disco purificado de proteína fluorescente, os risossomos ou o disco recombinante marcado. Os fragmentos são incubados com as células receptoras de interesse.

O azul de trian é então adicionado para extinguir a fluorescência extracelular e a invasão é visualizada por microscopia confocal. Até agora, a agregação proteica não foi reconhecida como uma característica das doenças mentais crônicas, como a esquizofrenia. Onde a proteína um interrompida na esquizofrenia é um candidato à invasividade celular, os agregados proteicos são uma característica marcante das doenças por desdobramento proteico.

Aqui demonstramos com dois métodos que agregados da proteína disc um são invasivos para as células e, portanto, que distúrbios relacionados ao disc um ou neuropatias associadas ao disc um são doenças conformacionais de proteínas. Os dois métodos são, em primeiro lugar, a purificação do disc completo, um ASOS, de linhagens celulares de neuroblastoma e, em segundo lugar, a expressão de um fragmento multimérico do disco um na extremidade C em *E. coli*, bem como a purificação e marcação com o corante fluorescente.

Embora o primeiro método resulte apenas em uma baixa eficiência de invasão celular de cerca de 0,3% das células que incorporam os microsomas purificados, o fragmento proteico recombinante puro infecta até 20% das células expostas. Os métodos descritos aqui devem ser transferíveis para outras proteínas nas quais a formação do acrossoma ou a montagem multimérica tenham sido convincentemente demonstradas. Em cada um dos 10 pratos de 10 centímetros.

Plante 1,5 vezes 10 elevado a seis células de neuroblastoma humano e células LF em meio RPMI 1640 suplementado e cultive durante a noite. No dia seguinte, as células devem estar de 70 a 80% confluentes. Rotule cinco placas para transfeção com PC DNA 3.1 MRFP e disc humano completo marcado com EGFP e cinco para transfeção com plasmídeo EGFP isoladamente. Para cada placa de 10 centímetros, combine 15 microgramas de DNA plasmidial, 30 microlitros de metafectina e 750 microlitros.

Opti MEM em um tubo de microcentrífuga e prepara pipetando para cima e para baixo, incuba à temperatura ambiente por 20 minutos. Em seguida, para transfectar as células, adiciona-se gota a gota a solução do reagente de transfeção de DNA às células, incubando-as a 37 graus Celsius com 5% de CO₂. Após 48 horas da transfeção, monitora-se a expressão da proteína fluorescente vermelha (MRFP) completa do disco um e confirma-se a formação de zonas de agregação em microscópio de fluorescência. Algumas células abrigam inclusões maciças de proteína fluorescente, conforme mostrado aqui.

Este protocolo combina um método para purificar corpos de Lewy a partir de tecido cerebral e o protocolo para isolar agregados maiores ou zonas de agregação, já que os métodos já existentes baseiam-se no uso de detergentes; por isso, o isolamento de proteínas livres de detergentes para aplicação em ensaios de invasividade celular é essencial. Em seguida, aspire o meio e lave com PBS, adicionando 400 microlitros de PBS contendo coquetel de inibidores de protease. Depois, raspe as células e adicione um mililitro de suspensão celular e 10 esferas cerâmicas a um tubo de lise de dois mililitros.

Lise as células usando três pulsos de 62º em um homogeneizador pre-cell lyse 24. A força mecânica do processo pode aumentar a temperatura dentro da amostra acima de 37 graus Celsius. Portanto, deve-se tomar cuidado para resfriar a amostra em gelo. Após o procedimento de lise, depois de resfriar as células em gelo, adicione cloreto de magnésio 10 milimolar e 40 unidades por mililitro de DNAA e incube por 60 minutos a 37 graus Celsius com agitação.

Prepare 10 mililitros de cada solução de sacarose a 80%, 50% e 20% (peso por volume) em PBS. Em seguida, em um tubo cônico de 15 mililitros, prepare o gradiente de sacarose começando com dois mililitros de sacarose a 80%, seguidos por dois mililitros de sacarose a 50% e dois mililitros de sacarose a 20%. Despeje o gradiente lentamente e tenha cuidado para não perturbar as camadas já adicionadas.

Em seguida, sobreponha o lisado digerido sobre o gradiente e centrifugue por 15 minutos a 1000 vezes G a quatro graus Celsius. Com a quebra, colete cuidadosamente a interface entre as camadas de sacarose de 50 a 80% com uma pipeta e misture com cinco volumes em um tubo cônico de 15 mililitros; centrifugue por 15 minutos a 1000 vezes G a quatro graus Celsius. Remova cuidadosamente o sobrenadante e mantenha a zona opaca contendo o pellet.

Repita a lavagem mais duas vezes nesta interface. As agrizonas são fluorescentes e podem ser visualizadas ao microscópio sob luz ultravioleta após a última lavagem; descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 250 a 500 microlitros de PBS. Este pellet contém as agrizonas purificadas.

Adicione 10 microlitros da suspensão de disco MRFP a cada poço de uma placa de 24 poços contendo células de neuroblastoma humano SHSY-5Y. Expresse constitutivamente GFP solúvel no disco um na extremidade C sobre lamínulas de vidro estéreis e incube por 48 a 72 horas após a incubação. Lave as células três vezes com PBS e quenche a fluorescência extracelular com azul de trian a 0,04% por cinco minutos.

Em seguida, lave com PBS para remover o azul de trian. A seguir, coloque a placa sobre gelo e adicione PFA a 4% em PBS por 10 minutos para fixar as células. Depois, lave uma vez com água estéril e monte as lamínulas em lâminas de vidro com meio de montagem prolongado dourado com DPI.

Confirme a captação na invasão de forma exógena. Aplique zonas de agressão por meio da colocalização com proteínas recrutadas expressas por células receptoras em imagens Zack. Este Zack abrange aproximadamente seis micrômetros de profundidade.

24 imagens capturadas em intervalos de 200 nanômetros. A fluorescência do disco MRFP em uma zona agri mostrada em vermelho recruta o disco GFPC terminal citosólico. Um fragmento mostrado em verde apresenta colocalização em amarelo, indicando que as zonas agri entraram no citosol do receptor e recrutaram a proteína do disco um anteriormente solúvel.

Nesta parte do protocolo, o disco humano um será marcado com DITE 5 94. Este D permite o monitoramento direto da proteína recombinante sem a necessidade de coloração imunoadicional. Comece liberando a proteína preparada conforme descrito no documento anexo do beta-mercaptoetanol, realizando três diálises em dois litros de PBS em uma diluição de um para 2000.

A seguir, rotule um disco de um miligrama com DITE 5 94 IDE, dissolva um miligrama por mililitro de proteína em PBS e adicione TCEP a cinco milimolares para recuperar grupos SH livres; adicione 20 microlitros do corante dissolvido em DMF à reação e incube por duas horas à temperatura ambiente. Utilizando uma cassete de diálise SLI com limite de peso molecular de 10.000 daltons, realize a diálise da proteína três vezes em PBS numa proporção de 1 para 2000, durante duas horas a cada vez. A seguir, para aumentar ainda mais a pureza da proteína marcada.

Realiza-se uma purificação por afinidade baseada em marcação com etiqueta hiss em uma coluna de NI NTA. Lave um mililitro de matriz de NI NTA com 10 mililitros de PBS, em seguida, aplique a proteína dialisada marcada à coluna e deixe-a passar pela coluna.

Lentamente, a solução perderá parte de sua cor azul devido à ligação da proteína à matriz NTA; o corante livre não marcado permanecerá no fluxo que passa. Uma vez que a solução proteica tenha passado pela coluna, lave a coluna três vezes com 20 mililitros de PBS para eluir a proteína e adicione dois mililitros de PBS contendo 500 milimolares de ole à coluna.

Regule a válvula para baixa velocidade e elua gota a gota, monitorando a banda colorida na coluna N NI NTA. Para ser referida, esta fração colorida do eluato contém uma proteína recombinante marcada; transfira o EIT para um cassete de diálise SLI e realize diálise do EIT três vezes contra 10 milimolares de NAPI, com diluição de 1 para 2000, durante duas horas cada, em dois litros. Após a diálise, empurre o EIT através de um filtro estéril de seringa de 0,45 micrômetros, em seguida alíquota em cinco amostras de 100 microlitros e congele rapidamente em nitrogênio líquido.

A quantidade total de proteína deve ser de 0,5 a um micrograma por mililitro em cada alíquota de 100 microlitros. Para avaliar a invasividade da proteína, adicione meio contendo cinco a dez microgramas por mililitro da proteína disc um recombinante marcada a cada poço de uma placa de 24 poços contendo células de neuroblastoma humano SH-SY5Y receptoras, expressando constitutivamente a etiqueta GFP solúvel na extremidade C-terminal de disc um, sobre lamínulas de vidro estéreis, e incube por 48 a 72 horas.

Quenche a fluorescência extracelular, fixe e monte as células como feito para as células tratadas com a zona agri, confirmando a invasão da proteína recombinante aplicada exogenamente por meio da imagem Zack. Quando a proteína marcada é internalizada, ela é detectada dentro do perímetro das células receptoras nas imagens geradas por microscopia confocal. Este Zack abrange aproximadamente cinco micrômetros de profundidade em 24 etapas de 220 nanômetros.

Aqui, o fragmento recombinante do disco um, de 5 98 a 7 85, mostrado em vermelho, é incorporado por células receptoras que expressam a forma solúvel do disco um, marcada com GFP na extremidade C, mostrada em verde, para determinar a invasividade do disco um. Agregados proteicos de disco um completo marcados com MRFP, denominados zonas agro, foram purificados de células NLF e aplicados a células SH-SY5Y receptoras conforme descrito nesta foto, conforme mostrado aqui. O disco um marcado com A-M-R-F-P no acrossoma invadiu uma célula de neuroblastoma humano SH-SY5Y que expressa a forma solúvel do disco um marcada com GFP na extremidade C.

Além disso, o disco um asomo marcado com MRFP foi capaz de recrutar o disco um marcado com GFP solúvel em agregados insolúveis para determinar a invasividade. O disco um recombinante marcado com luz DIA foi aplicado a células de neuroblastoma SH-SY5Y que expressam disco um GFP solúvel, conforme mostrado aqui. A proteína recombinante disco um, mostrada em vermelho, invadiu a célula receptora; pontos amarelos indicam o recrutamento do disco um C-terminal marcado com GFP solúvel em agregados. O disco um recombinante expressado e purificado de E. coli também demonstrou ser invasivo às células em neurônios in vivo, quando a proteína multimérica foi injetada estereotaxicamente na córtex pré-frontal medial de uma rata. A imagem de Zack confirma a presença da proteína recombinante disco um em neurônios corticais de rato, corados com um anticorpo contra núcleos neuronais.

Acabamos de mostrar a você dois métodos para gerar agregados da disc one para o estudo da invasão celular. Utilizando qualquer um desses métodos, podemos investigar os efeitos celulares da captação de agregados da disc one sem as variáveis potencialmente confundidoras da expressão gênica recombinante por transfeção de DNA estranho. Essas técnicas podem ser aplicadas para investigar os efeitos biológicos da patologia proteica da disc one in vitro em células, e in vivo por inoculação intracerebral ou outra administração em modelos animais.

Estamos confiantes de que essas técnicas também poderão ser transferidas para outros agregados proteicos eventualmente, com pequenas modificações no protocolo adotado para cada proteína específica. Ao realizar este procedimento, certifique-se de dedicar tempo para uma análise cuidadosa das imagens de microscopia confocal.