Método de extrusão constante pressão controlada para a Preparação de vesículas lipídicas nanométricas

O objetivo geral do experimento a seguir é apresentar um método de preparação robusto para vesículas lipídicas de relevância biológica. Isso é alcançado pela mistura e transferência de fosfolipídios para frascos de vidro e sua hidratação com tampão aquoso para criar uma suspensão de vesículas multilamelares (SLE). Como segundo passo, realiza-se um método de congelamento e descongelamento, que subsequentemente resulta na produção de vesículas Ella a partir de vesículas multilamelares.

Em seguida, a suspensão de lipossomos é passada por um extrusor utilizando a pressão ideal determinada para produzir vesículas lipídicas homogêneas de um tamanho desejado. Foram obtidos resultados que demonstram tamanhos consistentes de vesículas submicrométricas com base na dispersão dinâmica da luz e na análise de rastreamento de nanopartículas. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como sonicação e sedimentação, é que este método utiliza um sistema de controle de pressão com taxas de fluxo de nitrogênio ideais determinadas para o preparo eficiente do tamanho das vesículas lipídicas.

Para iniciar este procedimento, obtenha um frasco de vidro de 20 mililitros com tampa revestida de teflon, limpe todo o material de vidro e as seringas com clorofórmio antes do uso para evitar contaminação. Transfira 100 microlitros de clorofórmio grau reagente para o frasco de vidro utilizando uma seringa de vidro hermética de 250 microlitros. Adicione 30 microlitros de metanol grau reagente ao mesmo frasco de vidro utilizando uma seringa de vidro hermética de 100 microlitros.

Prepare uma solução lipídica de colesterol pop C a dois milimolares transferindo 216 microlitros de pop C a 10 miligramas por mililitro, 42 microlitros de pop E a 10 miligramas por mililitro e 20 microlitros de colesterol a 11 miligramas por mililitro para um frasco de vidro de 20 mililitros. Evapore os solventes orgânicos utilizando um fluxo lento de argônio ou gás nitrogênio até que uma película fina de lipídios seja observada no fundo do frasco. Coloque o frasco de vidro sem tampa em um dessecador a vácuo por pelo menos 30 minutos.

Para remover o solvente residual, transfira dois mililitros de tampão previamente passado por um filtro de 0,2 mícrons para o frasco de vidro para hidratar os lipídios. Incube a mistura a quatro graus Celsius durante a noite e utilize dentro de 48 horas para lipossomos com tamanhos entre 30 e 100 nanômetros. Congele a suspensão de lipossomos em nitrogênio líquido por 15 segundos.

Em seguida, descongele a suspensão de lipossomos utilizando um bloco de aquecimento a 42 graus SIUs por aproximadamente três minutos. Repita o processo de congelamento e descongelamento por um total de cinco ciclos. O congelamento e subsequente descongelamento produz Ela Les a partir de vesículas multilamelares e aumenta a eficiência de aprisionamento lipídico durante a extrusão.

Em seguida, prepare-se para a extrusão seguindo as instruções do Avastin para montar cuidadosamente o lipo tão rápido. A montagem correta do extrusor LF 50 é fundamental para evitar vazamentos de nitrogênio, o que afeta as taxas de fluxo desejadas. Para garantir o sucesso, realize os seguintes passos com cuidado.

Para produzir um selo hermético, coloque a tela de suporte de orifício grande na base do filtro de suporte, seguida pelo disco circular central, um disco drenante e uma membrana de policarbonato. Coloque a pequena junta preta (O-ring) sobre a membrana e fixe-a à base do filtro de suporte.

Prenda o extrusor de filtro superior apertando quatro parafusos nos quatro orifícios correspondentes. Monte a unidade de extrusão de filtro abaixo do cilindro grande do extrusor. Adicione a solução de lipossomos ao cilindro superior do barril de extrusão.

Coloque uma junta toróica grande, tampa estreita, outra junta toróica grande e a tampa circular. Conecte o regulador de gás à parte superior do cilindro do extrusor e feche todas as válvulas para evitar vazamento de ar, incluindo a válvula de alívio de pressão. Posicione um frasco de vidro de 20 mililitros ou um erlenmeyer de 50 mililitros sob a unidade de filtro do extrusor.

Uma válvula de segurança está conectada ao regulador e será acionada se a pressão exceder 600 PSI. Ligue o gás nitrogênio e abra a válvula de gás conectada ao extrusor. Aumente a pressão de nitrogênio para 25 PSI para lipossomos de 400 nanômetros, até 125 PSI para lipossomos de 100 nanômetros, e para 400 a 500 PSI para lipossomos de 30 nanômetros. Observe a suspensão de lipossomos até que ela seja expelida para o recipiente, sendo empurrada pelo nitrogênio.

Mantenha o fluxo de nitrogênio até que nenhum líquido seja observado. Passando pelo filtro do extrusor até o frasco de vidro para realizar a análise de DLS. Primeiro, prepare 50 microlitros de uma solução de lipossoma a 20 micromolar diluída em solução salina tamponada com fosfato ou PBS.

Em seguida, ligue a fonte de energia e a fonte da lâmpada. Prossiga abrindo o software dynapro. Configure o software para o modelo de algoritmo que detecte lipossomos no tamanho desejado.

Após conectar-se ao equipamento, pipete 14 microlitros da amostra de lipossoma no vial de quartzo e insira-o no suporte da cubeta; pressione iniciar. Após aproximadamente 20 a 30 aquisições, pressione parar. Analise os picos do diâmetro médio dos lipossomos registrados no histograma. A análise de rastreamento de nanopartículas começa com a preparação de uma solução de lipossomos de 500 microlitros a 0,1 micromolar solubilizada em PBS; enxágue o compartimento da amostra com água e etanol.

Em seguida, seque o compartimento da amostra com um papel toalha livre de fiapos. Ligue a fonte de alimentação do laser e o computador, e adicione 300 microlitros de solução de lipossoma 0,1 molar ao compartimento da amostra. Abra o controle de temperatura e o software de análise de rastreamento de nanopartículas.

Pressione o botão de captura para ligar o laser. Utilize os ajustes horizontais e verticais para mover a platina e ajustar o foco do microscópio. Defina a temperatura desejada e o tempo de gravação.

Pressione o botão de gravação para capturar múltiplos quadros de imagem das partículas de lipossoma por um período de tempo especificado. Analise os picos correspondentes aos tamanhos de diâmetro dos lipossomas no histograma conforme ele rastreia o movimento de cada partícula. A DLS é um método estabelecido que coleta luz dispersa para determinar o diâmetro das partículas e foi realizada para determinar os tamanhos dos lipossomas.

Os lipossomos hidratados foram extrudidos através de membranas de policarbonato em diversos tamanhos e pressões, conforme descrito no protocolo escrito. Os diâmetros dos lipossomos medidos por DLS para tamanho de poro de 30 nanômetros foram de 66 ± 28 nanômetros. Para tamanho de poro de 100 nanômetros, foram de 138 ± 80 nanômetros, e para tamanho de poro de 400 nanômetros, foram de 360 ± 25 nanômetros.

Uma suspensão de microesferas de Irene politidas de 50 nanômetros foi utilizada como padrão de calibração, registrando um diâmetro de 47 ± 16 nanômetros. A porcentagem de polidispersidade indica que não há sobreposição entre os tamanhos dos lipossomos. É comum observar diâmetros superiores a 30 nanômetros ao utilizar análise de DLS, devido ao viés conhecido desse instrumento em relação a partículas maiores.

Apesar dessa limitação instrumental, a curva de calibração descreve uma correlação linear. A análise de rastreamento de nanopartículas é uma tecnologia nova que mede o tamanho de cada partícula a partir de observações diretas da difusão em um meio líquido, independentemente do índice de refração ou da densidade da partícula. Essa técnica de alta resolução pode ser usada para complementar a medição de lipossomos com DLS; os diâmetros registrados por NTA de 95 mais ou menos 48 nanômetros e 356 mais ou menos 51 nanômetros para duas soluções de poliestireno de 100 nanômetros e 400 nanômetros foram utilizados para calibração.

As soluções lipídicas apresentam diâmetro mais comparável ao DLS, produzindo tamanhos médios de 29 ± 14 nanômetros para tamanho de poro de 30 nanômetros, 95 ± 17 nanômetros para tamanho de poro de 100 nanômetros e 359 ± 73 nanômetros para tamanho de poro de 400 nanômetros. A ANP pode ser uma técnica de caracterização mais geral para quantificar partículas microscópicas, já que sua sensibilidade permite a medição de partículas entre 50 e 1000 nanômetros. A curva de calibração mostra uma correlação linear entre a pausa da membrana de policarbonato versus o diâmetro registrado pela ANP. Imagens de microscopia eletrônica de transmissão com contraste negativo mostram cada tamanho de lipossomo após extrusão — tamanhos de 3, 100 e 400 nanômetros — claramente distintos entre si.

A ampliação foi ajustada para 25.000 vezes, com a barra de escala representando 0,5 mícrons. Um experimento de curso temporal foi realizado com três tamanhos de lipossomos. A DLS foi medida para cada solução de lipossomos imediatamente após a extrusão.

Todas as soluções de lipossomos foram armazenadas a quatro graus Celsius durante a noite. Seus diâmetros foram registrados novamente por DLS após uma incubação noturna. Pouca ou nenhuma alteração foi observada após um período de incubação de 60 horas. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que múltiplas passagens através do filtro de extrusão melhorarão a homogeneidade da solução Vesco.

Além disso, lembre-se de usar frascos e seringas de vidro para o preparo da amostra, a fim de evitar contaminação por lixiviação proveniente de tubos de polipropileno pelo clorofórmio.