On-Chip fenotipagem endotelial Inflamatória

O objetivo deste vídeo é demonstrar uma técnica de laboratório em um chip para caracterizar o estado inflamatório de células endoteliais. Para começar, células endoteliais aórticas humanas são cultivadas até a confluência sobre um substrato de cultura de tecidos e, em seguida, inseridas em um dispositivo de cisalhamento de placa Conan. As células são tratadas com a citocina pró-inflamatória TNF alfa e simultaneamente expostas a condições diferenciadas de tensão de cisalhamento durante quatro horas, controlando-se com precisão a rotação do cone acima do substrato, em que a tensão de cisalhamento modula uma resposta inflamatória bem caracterizada à citocina.

Isso inclui a superexpressão de moléculas de adesão, como VCA-1 e ICAM-1. O substrato é transferido para a platina de um microscópio, onde o dispositivo microfluídico A-P-D-M-S é selado a vácuo diretamente sobre a monocamada, criando canais de fluxo. Células monócitas ativadas, linhagem THP-1, são conduzidas sobre o hs pré-condicionado, onde se ligam em proporção ao nível de expressão das moléculas de adesão celular.

O estado inflamatório do endotélio é determinado pela quantificação do número total de células THP-1 que estão firmemente aderidas. Olá, meu nome é She D Diverse, e eu sou Greg Foster. E eu sou Keith Bailey.

Estamos nos laboratórios dos professores Pastor e Simon do Departamento de Engenharia Biomédica da Universidade da Califórnia em Davis. Hoje vamos descrever o uso de uma abordagem baseada em laboratório em um chip para examinar quantitativamente a disfunção endotelial e a inflamação. Essas ferramentas fornecem uma plataforma para realizarmos estudos relacionados à superposição de estresse metabólico com fatores hidrodinâmicos e à regulação do fenótipo inflamatório endotelial e da suscetibilidade à aterosclerose.

Assim, referimo-nos aos nossos dispositivos como câmaras microfluídicas miméticas vasculares, ou CMMV. Esses dispositivos permitem quantificar desfechos inflamatórios em células endoteliais e monócitos sob condições que simulam aquelas presentes em vasos aterogênicos. A CMMV facilita o uso de pequenas quantidades de reagentes ou materiais que podem estar em oferta limitada.

Eles também podem ser construídos em diversos formatos e geometrias personalizáveis, tornando-os muito adequados para uma ampla gama de aplicações. Hoje demonstraremos um experimento representativo utilizando nossa abordagem de laboratório em um chip. Monocamadas endoteliais humanas serão expostas à ativação por citocinas sob tensões de cisalhamento bem definidas.

Vamos demonstrar o uso da VMC para quantificar, em tempo real, o recrutamento de células monócitas humanas à monocamada como uma leitura funcional da ativação endotelial, utilizando substratos circulares de três polegadas usinados a partir de placas de cultura de tecidos de 100 milímetros. Os substratos de três polegadas são lavados com água destilada e, em seguida, esterilizados por imersão em etanol 70%. Os substratos estéreis são colocados em placas de Petri de 100 milímetros e deixados secar.

Em seguida, são incubadas com colágeno tipo I numa concentração de 100 microgramas por mililitro durante uma hora à temperatura ambiente e lavadas com PBS. Células endoteliais da aorta humana ou HA são suspensas numa concentração de 650.000 células por mililitro. Um mililitro da suspensão celular é colocado em gotas sobre um substrato seco revestido com colágeno e distribuído em uma suspensão uniforme.

Os substratos posicionados são então colocados em uma incubadora a 37 graus com 5% de CO₂ e deixados aderirem à superfície do substrato. Após uma hora, nove mililitros de meio de crescimento E GM dois são adicionados e as células são deixadas crescerem até formarem monocamadas com aproximadamente 90% de confluência. As monocamadas estão prontas para serem usadas em experimentos subsequentes de cisalhamento. Câmaras microfluídicas miméticas vasculares são construídas despejando o molde de A-P-D-M-S sobre uma forma mestre que compreende a geometria do canal desejada.

A base de silicone é despejada em um barquinho de plástico, seguida pelo agente de cura de silicone numa proporção de dez para um em peso. O gel de PDMS é então bem misturado, tomando cuidado para não raspar as laterais do barquinho, evitando assim introduzir partículas de plástico na mistura. Os moldes de fotolito são limpos com hexano e preparados para moldar o VMMC.

A mistura de PDMS é então despejada sobre o molde-mestre e colocada em uma câmara de vácuo. Na câmara, o ar é removido da mistura de PDMS e sobe à superfície após 15 minutos.

O molde é removido da câmara e o ar é soprado suavemente sobre a superfície de PDMS para eliminar as bolhas de ar remanescentes no molde. Em seguida, o molde é coberto e colocado em uma estufa a 37 graus por uma hora, tempo no qual o PDMS é deixado curar. Retire o gel de PDMS solidificado da estufa e faça incisões circulares ao redor da câmara usando um pequeno bisturi.

É fundamental fazer isso gradualmente para evitar o contato com o material de resistência fotográfica, pois isso danificará o molde mestre. Recorte a câmara microfluídica do molde, perfurando as portas de entrada e saída de cada canal com uma agulha lure lock de calibre 19. Além disso, faça furos para os tubos de vácuo longe dos canais.

A preparação para o VMMC está agora concluída. Pipete a citocina pró-inflamatória TNF alfa em seis mililitros de meio L 15 para obter uma concentração final de 0,5 nanogramas por mililitro. O meio L 15 é utilizado aqui como fluido de cisalhamento devido à sua capacidade de tamponamento de pH na ausência de CO2 a 5%.

O meio é então aspirado para uma seringa estéril de 10 mililitros, que é usada para carregar o dispositivo de cisalhamento. A monocamada confluente é então transferida para o dispositivo de cisalhamento celular, que foi esterilizado com etanol, nivelado e com a altura do entreferro do cone ajustada. O substrato é removido da placa de Petri e colocado sobre o bloco padrão de vidro, centralizado e cuidadosamente inserido na parte inferior da câmara de alojamento, de modo que o cone fique diretamente acima das células.

O substrato é fixado apertando uniformemente parafusos de aço inoxidável ao redor do bloco de referência. Em seguida, o meio de cisalhamento é carregado na câmara, tomando cuidado para não introduzir bolhas de ar. Depois, um computador é utilizado para inserir o programa desejado de tensão de cisalhamento e o motor micro separador é ligado.

Aqui utilizamos uma cisalhamento oscilatório de zero mais ou menos cinco dina por centímetro quadrado. Após quatro horas, o programa de cisalhamento é interrompido. O calibrador é removido e o substrato é cuidadosamente colocado de volta na placa de Petri.

As células estão agora prontas para o ensaio de adesão de monócitos. Imediatamente após a cisalhamento, as monocamadas de HA são transportadas para a estação do microscópio para a montagem do VMMC. O VMMC é conectado à mangueira de vácuo e submerso em água desionizada para remover quaisquer bolhas de ar aprisionadas nos canais.

Com a válvula de vácuo inicialmente desligada, a câmara é cuidadosamente pressionada sobre a monocamada e a válvula de vácuo é ligada. É fundamental garantir que nenhuma bolha de ar tenha ficado aprisionada nos canais da câmara. Agora, 80 microlitros de HBSS com cálcio e magnésio são pipetados em um reservatório feito a partir do corte da ponta de uma agulha Lure Lock de 19 Gauge; o fluido é expelido pela ponta ao pressionar firmemente o topo do reservatório, que então é inserido na porta de entrada do VMMC.

O conjunto completo é colocado sobre a platina do microscópio e a câmera do microscópio e o monitor de vídeo são ligados. Uma seringa de vidro de 10 mililitros é acoplada à bomba de seringa. Em seguida, a tubulação da seringa é conectada à saída do VMMC.

A taxa de fluxo é ajustada para induzir uma tensão de cisalhamento de uma dina por centímetro quadrado dentro do canal e, em seguida, é executada em modo de reenchimento, de modo que a seringa puxe o fluido do reservatório através do canal. As células P1 estimuladas com SDF1 são suspensas numa concentração de 2 milhões de células por mililitro. Dentro de dois minutos após a ativação do fluxo, 50 microlitros da suspensão celular são adicionados ao reservatório.

Novamente, tomando cuidado para não introduzir bolhas de ar ao estabelecer completamente o fluxo. O vídeo é capturado a três quadros por segundo e os dados são enumerados usando o software Image J. Células aderentes THP-1 são definidas como aquelas que se movem menos de metade do diâmetro celular em 10 segundos.

Aqui demonstramos dados que retratam a adesão de células THP-1 a monocamadas de HA estimuladas com TNF-alfa e condicionadas sob estresse cisalhante contínuo elevado de 15 dinas por centímetro quadrado ou sob estresse cisalhante oscilatório de zero mais ou menos cinco dinas por centímetro quadrado. Monocamadas de HA condicionadas com estresse cisalhante oscilatório exibiram recrutamento de células THP-1 três vezes maior em comparação com monocamadas expostas a alto estresse cisalhante. Hoje, demonstramos o uso de técnicas in vitro personalizáveis que podem ser combinadas para fornecer informações importantes sobre os eventos inflamatórios iniciais subjacentes à aterosclerose. Especificamente, quantificamos resultados associados à disfunção endotelial e a células expostas a estímulos inflamatórios sob condições hidrodinâmicas bem definidas.

O uso de CS VMM permite-nos examinar mecanismos específicos subjacentes às interações de adesão entre células endoteliais e leucócitos. Esses dispositivos também apresentam a vantagem de serem flexíveis e de baixo custo, além de facilitar o uso de materiais que podem ser limitados em quantidade, como componentes séricos derivados de seres humanos. Nossos estudos com esses dispositivos incluíram investigações sobre inflamação induzida por citocinas, lipídios e RAGE em células endoteliais.

Também desenvolvemos ensaios em chip para examinar mecanismos de adesão em múltiplos tipos de leucócitos, bem como em sangue total. Em última análise, prevemos que esta tecnologia conduzirá a abordagens ex vivo para avaliar o risco individual de doenças cardiovasculares mediadas por inflamação.