Um protocolo simples para extrair Hemócitos de Lagartas selvagens
15 de novembro de 2012
Hemócitos de insetos realizar muitas funções importantes, tanto imunes e não-imunes, em todas as fases do desenvolvimento do inseto. Nosso conhecimento atual de tipos de hemócitos e função vem de estudos sobre insetos modelos genéticos. Aqui, apresentamos um método para extrair, quantificar e visualizar hemócitos de lagartas selvagens.
O objetivo geral deste procedimento é extrair, visualizar e contar os hemócitos de lagartas silvestres. Isso é realizado primeiramente anestesiando a lagarta colocando-a sobre gelo, injetando nela uma solução tampão contendo um anticoagulante e devolvendo a lagarta ao gelo para permitir que os hemócitos retornem à circulação antes da extração. O segundo passo consiste em fazer uma incisão superficial na extremidade posterior da lagarta utilizando um bisturi limpo.
Em seguida, a lagarta é suavemente comprimida usando pinças macias. Depois, a mistura de linfa hemocélica com a solução tampão é aspirada com uma micropipeta e coletada em um tubo de microcentrifugação. O passo final é misturar suavemente a solução de linfa hemocélica com um volume igual de solução tampão e transferir 10 microlitros da solução para um hemocitômetro, a fim de visualizar e contar o número de hécitose.
Por fim, este método de extração de hemócitos pode ser utilizado como uma técnica rápida e eficaz para contar hemócitos de diversas espécies de lagartas e conservar como uma ferramenta para examinar aspectos fisiológicos da resposta imune celular dos insetos. A principal vantagem desta técnica é que ela pode ser usada para extrair hemócitos de lagartas com prox muito reduzido. Outros modelos de lagartas são sangrados mediante o corte de um dos pros, extraindo-se assim os hemócitos do líquido que sai.
Além disso, esta técnica pode ser utilizada para extrair hemócitos de outras espécies de insetos. Este método pode ser usado para responder perguntas fundamentais na área de ecoimunologia, como a forma como a resposta imune celular dos insetos varia com a qualidade da dieta, o estágio de desenvolvimento ou a exposição a diferentes patógenos. Para iniciar este procedimento, anestesie as larvas do penúltimo estádio por meio do resfriamento em gelo durante 20 minutos antes da extração dos hemócitos.
Em seguida, encaixe a extremidade romba de uma agulha capilar limpa de calibre 16 na tubulação conectada a uma seringa de vidro de 20 mililitros. Deixe o tubo contendo a solução de coleta aberto sobre a bancada do laboratório. Encha lentamente a capilar com aproximadamente 10 a 15 microlitros de tampão.
Em seguida, apoie a agulha em uma bola de argila colocada ao lado do microscópio estereoscópico. Coloque a lagarta em uma placa de Petri. O inseto deve ser posicionado de lado para que as esferas fiquem claramente visíveis.
Enquanto observa sob um microscópio estereoscópico, segure a lagarta no lugar com um par de pinças e posicione a agulha próxima a uma das esferas onde a cutícula do inseto geralmente é mais macia. Em seguida, pressione suavemente a agulha capilar contra o corpo do inseto. Assim que a agulha penetrar a cutícula, injete todo o volume da solução na lagarta.
O corpo da larva irá inchar após a injeção, mas não deve estourar nem vazar. Devolva a larva à placa de Petri com gelo. Posicione o inseto em posição dorsal para evitar que o tampão saia pelo ferimento.
Repita as injeções para cada lagarta utilizada na extração de hemolinfa. Em seguida, deixe todos os insetos resfriarem em gelo por 30 minutos. Agora, coloque a lagarta em uma placa de Petri sob o microscópio estereoscópico.
Realize cuidadosamente uma incisão rasa com cerca de dois a três milímetros de comprimento na região posterior da lagarta, utilizando um bisturi estéril sem danificar o intestino ou outros órgãos internos. Em seguida, comprima suavemente a lagarta usando uma pinça plástica flexível enquanto coleta aproximadamente 10 a 20 microlitros da mistura hemolinfática com uma ponteira de pipeta de 10 microlitros. Novamente, tenha cuidado para não lesionar os tecidos internos.
Depois disso, descarte os restos das lagartas. Colete o hemo linfo de cada lagarta em tubos microcentrífugos de 0,5 mililitro silanizados e individualmente rotulados. Em seguida, adicione aproximadamente 10 a 20 microlitros da solução de incubação a cada amostra de hemo linfo coletada de uma lagarta individual.
Mantenha as amostras de hemolinfa sempre em gelo nesta etapa. Misture a amostra de hemolinfa e a solução de incubação imediatamente antes da contagem. He cytes.
Este tratamento permite a separação adequada dos hemócitos e evita a formação de agregados. Utilize uma ponteira limpa para transferir 10 microlitros da amostra de hemolinfa misturada com a solução de incubação para um hemocitômetro. Em seguida, usando um microscópio composto, conte e registre o número de hemócitos em pelo menos 15 dos quadrados grandes da grade central do hemocitômetro.
Some esses valores para obter uma soma total do número de hemácias nas 15 quadrículas. Em seguida, enxágue o hemocitômetro e sua lamínula cuidadosamente usando um frasco lavador com água destilada e deionizada. Então, seque com lenços de papel Kim.
Repita os procedimentos para as demais amostras de hemo linfo e calcule o número médio de hemócitos por mililitro de volume de hemo linfo para cada lagarta. A imagem de microscopia de campo claro mostra os hemócitos extraídos de lagartas de nucle hin ai com uma ampliação de 20 x. Após este procedimento, os hemócitos coletados podem ser utilizados para estudar a resposta imune celular e montar ensaios como fagocitose e cap, seleção de encapsulamento e atividade de pH oxidase.
Além disso, R-N-A-D-N-A e proteína podem ser coletados sem uso para ensaios adicionais, com o objetivo de estudar essa resposta imune celular em insetos. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como injetar lagartas com a finalidade de extrair hemolinfa e de como coletar hemolinfa contendo hemócitos vivos.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um método para extrair, quantificar e visualizar hemócitos de lagartas silvestres. Os hemócitos desempenham papéis cruciais tanto em funções imunes quanto não imunes durante o desenvolvimento dos insetos.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Imunologia de insetos
- Função dos hemócitos
- Biologia do desenvolvimento
Contexto
- Os hemócitos são essenciais para as respostas imunológicas de insetos.
- Compreender os tipos de hemócitos auxilia no estudo da biologia dos insetos.
- O conhecimento atual baseia-se principalmente em modelos genéticos.
- Este estudo concentra-se em lagartas silvestres para ampliar o conhecimento existente.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método confiável para extração de hemócitos.
- Visualizar hemócitos para melhor compreensão de suas funções.
- Quantificar hemócitos para avaliar seu papel na fisiologia de insetos.
Métodos Utilizados
- Anestesiar lagartas em gelo.
- Injetar uma solução tampão com anticoagulante.
- Realizar uma incisão superficial para facilitar a extração de hemócitos.
- Aspirar o hemolinfa e misturá-lo com tampão para análise.
Resultados Principais
- Extração e visualização bem-sucedidas de hemócitos.
- Quantificação de hemócitos utilizando um hemocitômetro.
- Demonstrou a viabilidade do método em lagartas silvestres.
- Forneceram informações sobre a circulação e função dos hemócitos.
Conclusões
- O método permite o estudo eficaz de hemócitos em lagartas silvestres.
- Amplia a compreensão das respostas imunológicas em insetos.
- Pode ser aplicado a outras espécies de insetos para estudos comparativos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A extração e quantificação confiáveis de hemócitos de lagartas silvestres permitem o estudo dos mecanismos de imunidade inata em espécies de insetos não-modelo, apoiando a validação inicial de alvos em imunologia de insetos. Este protocolo fornece um fluxo de trabalho padronizado para o isolamento de células imunes, facilitando estudos comparativos e ensaios funcionais relevantes para pesquisas translacionais e ecoimunologia. O método aumenta a confiança preditiva na caracterização da resposta imune, orientando decisões ajustadas ao risco em etapas de descoberta que envolvem modelos de insetos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação da diversidade e função de células imunes em insetos de espécies não modelo.
- Apoia a desmistificação biológica ao fornecer acesso a células imunes primárias para estudos mecanicistas.
- Facilita a validação funcional de alvos por meio de ensaios imunológicos subsequentes.
- Aprimora a confiança preditiva em hipóteses sobre respostas imunes em pesquisas baseadas em insetos.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prepara amostras validadas de hemócitos para ensaios imunológicos quantitativos e funcionais.
- Padroniza a extração e contagem celular, favorecendo a reprodutibilidade entre experimentos.
- Permite o preparo escalonável de hemócitos para triagem de efeitos de patógenos ou compostos.
- Fornece números confiáveis de células para normalização de ensaios e análise comparativa.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se com estudos de ecoimunologia ao permitir o perfil imunológico em populações silvestres.
- Apoia a continuidade desde a coleta de campo até ensaios funcionais baseados em laboratório.
- Facilita o avanço com ajuste de risco de modelos de insetos para pesquisa translacional.
- Oferece desvio mecanicista de risco para estudos de modulação imunológica e interação com patógenos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este protocolo de extração de hemócitos situa-se na interface entre a descoberta inicial e o desenvolvimento de ensaios, permitindo estudos de células imunes orientados por hipóteses em modelos de insetos silvestres.
- Biologia Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre diversidade e função de células imunes em insetos não modelados.
- Triagem: Fornece preparações padronizadas e quantitativas de hemócitos para ensaios imunológicos subsequentes.
- Análise: Fornece contagens celulares e dados morfológicos para comparar respostas imunes entre diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta a coleta de campo com o perfilamento imunológico em laboratório para estudos de ecoimunologia e estudos comparativos.
- Reutilização em Escala: Oferece um protocolo reutilizável adaptável a diversas espécies de lepidópteros e insetos aparentados.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva em estudos de células imunes e reduz a ambiguidade mecanicista na imunologia de insetos.
- Valor Operacional: Padroniza a extração e contagem de hemócitos para fluxos de trabalho reproduzíveis e escaláveis.
- Valor Estratégico: Permite decisões informadas de prosseguir ou não em pesquisas imunológicas baseadas em insetos e em fluxos de ecoimunologia.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de modelos de insetos para estudos funcionais e translacionais.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência no manejo de insetos e em técnicas de microdissecção.
- Exige acesso a microscópios estereoscópicos e microscópios compostos, hemocitômetros e instrumentos estéreis.
- Exige padronização entre equipes para protocolos de coleta de amostras e contagem de células.
- Pode ser adaptado a diversas espécies de lepidópteros e insetos relacionados com modificações mínimas.
- O rendimento da amostra e a viabilidade celular podem variar conforme a espécie e o estágio de desenvolvimento.
