Um Ensaio Galvanotaxis para Análise de Precursores Neurais Cinética migração celular em um campo aplicado externamente Corrente Contínua Elétrica

O objetivo geral deste procedimento é visualizar a migração de células precursoras neurais derivadas de adulto na presença de um campo elétrico contínuo. Isso é realizado primeiramente isolando e cultivando células precursoras neurais subependimárias do camundongo adulto. A próxima etapa consiste em preparar as câmaras Galvan Axxis e transferir as células precursoras neurais para dentro das câmaras.

O passo final consiste em aplicar um campo elétrico de corrente contínua através da câmara Galvan Axxis e realizar a microscopia de imagem em intervalos para observar a migração dos precursores neurais. Em última análise, a microscopia de imagem em intervalos captura as propriedades galvanotáticas dos precursores neurais em seus estados diferenciado e indiferenciado. Embora este método possa fornecer informações sobre a galvanose dos precursores neurais, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como um modelo de acidente vascular cerebral em camundongo para o recrutamento de precursores neurais para locais de lesão, a fim de potencializar a reparação neural.

Quem demonstrará o procedimento será Rob Pilley, um estudante de pós-graduação do meu laboratório. Ao iniciar este procedimento, as NPCs devem estar em cultura há sete dias, para que neuroesferas primárias livres em suspensão estejam prontas para serem colhidas. Quando necessário, comece a preparar três câmaras Galvan Axxis colocando três vidros quadrados.

Primeiro, deixe lamínulas em um frasco com ácido clorídrico normal 6 durante a noite. Cedo no dia seguinte, monte o gel Matra para descongelar lentamente sobre gelo. Após quatro horas, ele estará pronto para uso na montagem da câmara.

Primeiro, utilize um cortador de vidro com ponta de diamante para cortar seis tiras retangulares de vidro a partir de lâminas quadradas novas número um. Transfira as lâminas quadradas e as tiras retangulares previamente lavadas com ácido para uma cabine de fluxo laminar.

Lave as tiras de vidro com etanol 70%, seguido por água estéril para cultura de tecidos. Deixe-as secar ao ar ou seque-as em papel sem fiapos. Em seguida, aplique graxa de vácuo ao redor da borda de uma das faces de cada lâmina de vidro quadrada e sela-as à base de plástico de 60 milímetros.

Placas de Petri. Aplique graxa de vácuo em um lado das tiras de vidro retangulares e selle-as nas bordas opostas do quadrado. Lâminas de vidro para criar quadrados com uma canaleta central no centro de cada placa.

Ultravioleta esterilize esses quadrados ou câmaras de vidro modificados por pelo menos 15 minutos em uma câmara de fluxo laminar. Em seguida, pipete de 250 a 300 microlitros de poliolisina na ranhura central das câmaras. Incube então as câmaras à temperatura ambiente por duas horas, aproximadamente 15 minutos antes do término da incubação.

Após duas horas, prepare a solução de Matrigel, aspire a poliolisina e lave as ranhuras centrais com um mililitro de água autoclavada. Em seguida, pipete de 250 a 300 microlitros da solução de Matrigel nas ranhuras centrais e incube as câmaras a 37 graus Celsius por uma hora. Após a incubação, aspire a solução de Matrigel.

Em seguida, lave suavemente os sulcos centrais com um a dois mililitros de SFM. Agora, pipete 100 microlitros de E-F-H-S-F-M ou F-B-S-S-F-M nos sulcos centrais, em preparação para as células cultivadas. A seguir, pipete quatro a cinco mililitros da cultura contendo neuroesferas em um novo recipiente de Petri de 60 milímetros.

Em seguida, coloque a placa de Petri sobre a platina do microscópio de contagem sob a objetiva de cinco x. Utilize uma pipeta P 10 para transferir suavemente de cinco a oito neuroesferas inteiras para o sulco central de cada câmara. Até quatro.

As neuroesferas podem ser transferidas imediatamente, mas não as dissocie enquanto estiverem nas calhas centrais. Espalhe-as cuidadosamente sem perturbar o substrato de Matrigel. Em seguida, adicione mais 150 microlitros de E-F-H-S-F-M ou F-B-S-S-F-M nas calhas centrais.

Agora, cultive as células em um incubador umidificado. Após 17 a 20 horas em cultura, NPCs não diferenciados estarão disponíveis após 69 a 72 horas. Em cultura, NPCs diferenciados estarão disponíveis.

Sob microscópio invertido, selecione a câmara com as melhores células para análise de migração por imagem de células vivas. As células devem ser arredondadas, quase completamente dissociadas de seus neuroesferas, e ainda não tiverem, ou apenas começado a formar prolongamentos em uma cabine de segurança. Prepare uma tampa para a câmara.

Lave uma lamínula quadrada de vidro com etanol 70%, seguida de água autoclavada, e aplique uma fita de graxa de vácuo em duas bordas paralelas. Agora, cubra a câmara. Primeiro, aspire o meio de cultura do sulco central e, em seguida, sela rapidamente a lamínula sobre as paredes retangulares, como se fosse um telhado.

Em seguida, utilizando ação capilar, carregue 100 microlitros de meio fresco no sulco central. Agora, use graxa de vácuo para criar bordas para poças de meio de cultura. Em cada extremidade do sulco central no sistema de imagem de células vivas, prepare tubos de gel de agarose, eletrodos de prata e cloreto de prata, e dois recipientes de Petri de 60 milímetros para uso.

Como reservatórios de meio de cultura, deixe as câmaras em repouso no ambiente de 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 20 a 30 minutos. Durante esse período, prepare as tampas de dois recipientes de Petri vazios e a tampa do recipiente de Petri das câmaras Galvan Axxis perfurando orifícios com uma Dremel ou pipeta de ferramenta, adicione 1,5 a dois mililitros de meio em cada lado do sulco central e acrescente sete a oito mililitros de SFM em cada recipiente de Petri vazio. Coloque um recipiente de Petri em cada lado do sulco central da câmara e insira um eletrodo em cada recipiente.

Conecte a câmara aos recipientes de Petri para estabelecer a continuidade elétrica. Com as pontes de gel de Agros, conecte os eletrodos a uma fonte de alimentação externa com um medidor M em série para medir a corrente elétrica e ligue a fonte de alimentação. Use um voltímetro para medir a intensidade do campo elétrico diretamente ao longo do sulco central.

Ajuste a saída da fonte de alimentação conforme necessário. Agora inicie o módulo de lapso de tempo no sistema de imagem. No software Axio Vision, selecione a aquisição multidimensional e clique em ver.

Para os canais, selecione o canal seis e clique em T para o lapso de tempo. Defina as configurações de intervalo do lapso de tempo para um minuto e defina a duração para oito horas nos campos antes e depois do ponto de tempo, selecione o ponto de tempo anterior e posterior. Agora, clique em iniciar e deixe o experimento rodar pelo tempo desejado; após a conclusão do ensaio, prossiga com a análise de IHQ.

A análise cinemática revelou que na presença de um DCEF de 250 milivolts por milímetro, NPCs indiferenciados exibem um rápido e altamente direcionado movimento galvanoaxial em direção ao cátodo; nesta intensidade de campo, mais de 98% dos NPCs indiferenciados migraram continuamente durante as seis a oito horas inteiras em que foram monitorados. Na ausência de DCEF, observou-se movimento aleatório das células.

Como as células mortas não migram, isso sugere que elas permanecem viáveis durante esse período. Na ausência ou presença de A-D-C-E-F, os fenótipos diferenciados apresentaram migração desprezível, tanto na presença quanto na ausência de subconjuntos de células diferenciadas de A-D-C-E-F. Foram observados prolongamentos citoplasmáticos que tenderam a se alinhar perpendicularmente à direção do DCEF, mas nenhuma translocação visível do corpo celular foi observada.

A imunomarcação confirmou que as NPCs mantiveram expressão positiva do marcador de precursor neural nestina após seis horas de exposição ao campo elétrico de corrente contínua. Nos ensaios envolvendo NPCs induzidas a se diferenciarem em fenótipos maduros, a maioria das células expressa a proteína ácida fibrilar glial, ou GFAP, marcador de astrócito maduro, após seis horas de exposição ao campo elétrico de corrente contínua. Após este procedimento, pode-se obter informações sobre os mecanismos celulares envolvidos na transdução do campo elétrico de corrente contínua em motilidade celular por meio de modelos genéticos de knockout.

Ou senhor, um por exemplo.